结核杆菌聚集/生物膜成熟与药物耐受，持留菌分化相关机制研究

Although Mycobacterium tuberculosis spontaneously form biofilms under suitable in vitro conditions accompanied with differentiation of persister bacteria, which conferring extraordinary tolerance to multiple stresses including antibiotics. Mtb was reported to aggregate inside macrophages of granuloma in infected lungs. The evidence and mechanisms for Mtb biofilms in TB pathogenesis are not yet established. Here we hypothesize that aggregation of Mtb inside immune cells of granuloma not only leads to the necrosis of host cells, but further aggregates and forms biofilms in extracellular environment either in caseating necrotic center or, at later stage, in cavities. In our studies, transcriptome analysis will be performed with the samples collected from various development stages of biofilms in vitro and different states of granuloma tissues with special attention to the caseous necrotic core and surrounding in C3Heb/FeJ mice at chronic infection stages. Key genes and small RNAs involved in bacterial aggregation and maturation of biofilms will be identified. Further studies will be focus on the function of these genes and small RNAs in persistence, adaptation to multiple stresses including antibiotics, Mtb pathogenesis and host-pathogen interaction. Our studies will provide theoretical education for clinical therapy as well as new potential anti-TB targets.

结核杆菌在体外合适培养条件下可以形成生物膜，并伴随持留菌的分化，从而对抗生素在内的各种恶劣环境耐受。研究发现在慢性感染阶段，结核杆菌在宿主体内免疫细胞内发生聚集，但是否以及如何形成成熟生物膜尚未明确。我们推测结核杆菌在肉芽肿组织的免疫细胞内聚集生长至一定程度后不但导致宿主细胞级联式坏死，而且在中央酪样坏死的肉芽肿或者咳痰后形成的空洞中以细胞外聚集体状态继续生长聚集并发展为成熟生物膜。本研究从体外培养条件下的不同状态的结核杆菌着手，同时收集TB易感小鼠C3Heb/FeJ感染后期不同状态的肉芽肿组织，尤其是肉芽肿的酪样坏死中心及其外周，进行转录组学研究。筛选出与结核杆菌聚集/生物膜成熟相关关键基因和small RNAs, 进而研究其机制。此研究不但为TB的新药开发提供新的靶点，而且为TB的临床治疗提供理论指导。

结核病是一种由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染性疾病，是由单一传染性病原体引起的第二大感染性疾病，每年仍有数百万人新患结核病。目前结核病的现状依然十分严峻，主要由于缺乏快速准确的诊断手段、耐药结核的出现、与糖尿病或艾滋病等疾病共患、现有疫苗保护性不足等多重因素导致。因此结核病发病机制的研究亟待加强，以期为新型结核病干预与治疗手段的研发提供理论基础。.巨噬细胞通过溶酶体内的酸性水解酶降解被吞噬的病原微生物，从而对病原微生物进行杀伤，这是巨噬细胞发挥抗感染功能的最重要的机制之一。溶酶体酸化在清除病原微生物的过程中是相当重要的。我们研究结果表明在内质网上钙通道蛋白CACNA2D3缺失的情况下，溶酶体酸性水平大幅度下降。溶酶体表面的氢离子泵V-ATPase是控制溶酶体酸性的关键分子复合体。我们发现CACNA2D3的缺失大幅度上调v-ATPase调节亚基ATP6V1E1的Tyr56/57位点的磷酸化水平，提示该位点的磷酸化水平与溶酶体酸性水平成负相关。ER Ca~(2+)信号的减弱抑制溶酶体酸化，从而增强Mtb细胞内存活。.我们的筛选结果显示结核菌分泌蛋白Rv0754和Rv1184c可能是结核菌的毒力因子，敲除Rv0754和Rv1184c的菌株感染巨噬细胞后能够显著抑制结核菌的胞内存活。分泌蛋白Rv0754进入细胞浆后能够发生不可逆相变，从而抑制V1E1的蛋白表达，抑制溶酶体的酸化水平，抑制结核菌的胞内存活。我们的发现揭示了结核菌分泌蛋白Rv0754与宿主分子的相互作用，调节溶酶体酸化影响Mtb细胞内存活，可能支持宿主定向抗结核治疗方法的发展。