汉黄芩素诱导免疫性肿瘤细胞死亡的作用机理研究

最新研究表明，增强肿瘤细胞的免疫原性，提高抗原递呈细胞的识别和呈递效率，激发机体的抗肿瘤免疫应答，是避免肿瘤逃逸免疫系统监视的重要策略。本课题组前期研究表明，汉黄芩素可显著增强肿瘤细胞的免疫原性，诱导免疫性肿瘤细胞死亡（ICCD）。本项目的研究内容：1）进一步应用Real time PCR、IP、siRNA等手段，分析汉黄芩素促进钙网蛋白（CRT）和Annexin A1膜转位以及诱导HMGB1、HSP90/70和ATP释放的调控靶点，阐明其相关信号转导通路；2）应用siRNA等技术，从分子、细胞和整体水平系统研究CRT、Annexin A1和HMGB1等分子在诱导DC细胞对肿瘤细胞的识别、抗原递呈以及CTL细胞介导的免疫应答过程中的作用。通过上述研究，阐明汉黄芩素增强肿瘤细胞免疫原性，诱导ICCD的确切作用机制，为新药研发和制定合理的临床肿瘤综合治疗方案提供理论依据和实验基础。

增强肿瘤细胞的免疫原性，提高抗原递呈细胞的识别和呈递效率，激发机体的抗肿瘤免疫应答，是避免肿瘤逃逸免疫系统监视的重要策略。本课题组前期研究表明，汉黄芩素可显著增强肿瘤细胞的免疫原性，诱导免疫性肿瘤细胞死亡（ICCD）。本项目通过cDNA微阵列和二维电泳－SELDI-TOF-MS技术研究发现，汉黄芩素可以显著上调对化疗药物不敏感的人低分化胃癌MKN45细胞的CRT、HMGB1、Annexin A1等肿瘤免疫相关蛋白的表达，并呈现明显的剂量依赖性。进一步应用细胞免疫荧光结合激光共聚焦实验发现，给予汉黄芩素可以诱导CRT从胞浆向细胞膜分布。应用Western-blotting检测证实汉黄芩素可以显著诱导CRT、Annexin A1、和p22向细胞膜转位，增加肿瘤细胞的免疫原性，并且AKT抑制剂和mTOR抑制剂可以阻断CRT的膜转位，提示PI3K/AKT/mTOR通路参与CRT膜转位的调控。汉黄芩素可以促进MFC细胞释放ATP和HMGB1。汉黄芩素作用MFC细胞可以显著诱导ROS的产生，并且NAC可以抑制ROS的产生。同时，汉黄芩素可以显著诱导内质网应激，导致PERK和PKR磷酸化，并且激活PI3K/AKT/mTORC1通路，上述过程可以被NAC阻断，提示ROS是上有信号分子。进一步研究发现，ROS可导致PERK和PKR磷酸化，激活PI3K/AKT/mTORC1。骨髓来源的DC细胞（MoDCs）和MFC细胞混合培养，结果显示随着汉黄芩素浓度的增加，DC细胞吞噬的肿瘤细胞逐步增加，提示汉黄芩素可以增强肿瘤细胞的免疫原性，促进DC细胞对肿瘤细胞的设别和吞噬。体内试验进一步证实，汉黄芩素作用后的MFC细胞接种小鼠，可以对第二次接种在对侧腋下的MFC细胞的生长产生显著的抑制作用。综上所述，本项目应用蛋白质组学、IP、siRNA等手段，分析汉黄芩素促进钙网蛋白（CRT）和Annexin A1膜转位以及诱导HMGB1、HSP90/70和ATP释放的调控靶点，阐明其相关信号转导通路；2）应用siRNA等技术，从分子、细胞和整体水平系统研究CRT、Annexin A1和HMGB1等分子在诱导DC细胞对肿瘤细胞的识别、抗原递呈以及CTL细胞介导的免疫应答过程中的作用。通过上述研究，阐明汉黄芩素增强肿瘤细胞免疫原性，诱导ICCD的确切作用机制，为新药研发和制定合理的临床肿瘤综合治疗方案提供理论