参附汤有效组分配伍对心肌缺血再灌注损伤钙稳态的调控作用及机制研究

Shenfu decoction is an ancient classical herbal formulary for qi nourishing and yang restoring, which can be applied for ischemic heart diseases. The modulation mechanism of Shenfu decoction's herbal combination of either emphasis on qi tonifying or yang restoring as well as their consequent active ingredients combination for myocardium ischemia reperfusion has yet not been clarified. Our preliminary work shows that Shenfu decoction can regulate some calcium transporting proteins and its extractions can reduce the L type calcium channel currents of cardiomyocytes, while the combination of active ingredients of Shenfu Decoction shows either synergic or antagnistic regulation of LTCC, which may contribute differently to the regulation of calcium homeostasis, therefore, our study will focus on ischemic cardiomyocyte calcium homeostasis regulation of Shenfu decoction's herbal combination of either emphasis on qi tonifying or yang waring as well as their consequent active ingredients combination with patch clamp, laser confocal microscopy, Realtime-PCR and western-blot technique, so as to reveal either the coordinate or antagnistic function of the active components combination of Shenfu Decoction and provide experimental evidence for the rational use and further formulary improvement of Shenfu decoction.

参附汤具有益气温阳的功用。人参、附子不同配伍比例分别侧重益气或温阳，临床上治疗多种心肌缺血性疾病，而其人参附子不同配伍比例及有效组分配伍对心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其调控机制尚未阐明。前期研究表明参附汤提取液可对心肌细胞L型钙通道电流有抑制作用；而其组分配伍则呈现协同或拮抗效应；体内实验证明参附汤能够调节钙调控蛋白的表达。我们提出参附汤不同比例和有效组分配伍能够调控缺血再灌注心肌钙稳态的假说。为进一步揭示参附汤治疗缺血性心脏疾病的机理，拟通过大鼠在体及体外实验，运用膜片钳技术、激光共聚焦技术、分子生物学及组织病理学技术，对参附汤不同配伍比例/不同组分配伍改善大鼠心肌缺血效用及其调控缺血再灌注心肌钙稳态的作用及分子机制进行研究，并进一步通过参附汤有效组分的配伍效应，揭示方剂组分配伍调控多个分子靶点的效应机制，为参附汤的临床合理应用及组方配伍优化提供客观的实验依据。

本研究通过动物实验、细胞实验和分子实验初步探讨了参附汤有效组分及配伍对心肌缺血再灌注损伤的保护作用及通过L型钙通道和钙调蛋白调控钙稳态的分子机制结果显示，参附汤不同比例提取液对心肌缺血再灌注后血清指标LDH、CK、MDA等均有较为显著的改善作用，其中以参附汤提取液2：1比例的配伍改善更为明显，这在某种程度上说明了益气回阳传统经典名方参附汤在改善心肌缺血再灌注损伤的作用上，以益气为主，辅以温阳的配伍法更为符合，从临床资料分析，心肌缺血再灌注损伤的病机，当属心主阳气衰微，阴寒内盛，血瘀气滞，治疗的重点在益气温阳，参附汤在本病的治疗中具有基础性和根本性的治疗作用，进一步的体外实验研究以膜片钳技术为主，结合分子生物学技术对参附汤有效组分及配伍对缺氧复氧心肌细胞钙稳态的调控进行了较为系统的研究，结果显示参附汤提取液2：1 比例配伍对心肌离子通道有广泛的调节作用，参附汤提取液可以影响Na+和K+通道，对通道电流有较为显著的抑制作用，针对缺氧复氧心肌细胞模型，我们选择人参皂苷Re、Rg1、Rd和乌头原碱等作为参附汤有效组分的代表，结果显示：参附汤有效组分配伍可以有效地抑制L型钙通道电流，其调控机制可能是通过调节NO-PKG通路上游的这种抑制性的白蛋白而部分实现的；钙稳态调控相关蛋白本研究以H9C2缺氧复氧细胞为模型，较为深入地研究了参附汤三种有效组分Re，Rg1，Aconine及其配伍对H9C2缺氧复氧细胞的保护作用及分子机制。结果显示不同有效组分可作用于不同靶点，Re可提高SERCA2a蛋白的表达，增加肌浆网钙泵对胞内钙离子的回摄；Rg1既可以提高SERCA2a的表达，同时也作用于NCX1，使其表达降低。表明Rg1在使肌浆网钙泵对胞内钙离子回摄的同时，也减少了反向工作模式的NCX1的表达，减少了Na+与Ca2+的交换；Aconine作用于膜通道蛋白Cav1.2，降低Cav1.2的表达，减少了胞外钙离子通过钙离子通道进入胞内，最优配伍则可以综合三者作用，实现三种有效组分作用靶点的整合。即对三种蛋白表达均有影响，降低NCX1、Cav1.2蛋白的表达，提高SERCA2a的表达。