基于温敏性水凝胶和脂肪干细胞的自体组织工程尿道补片治疗尿道狭窄的实验研究

Urethral stricture, which seriously affects patient`s quality of life, remains a challenge for urologists. Traditional treatments, such as urethral dilatation and placement of urinary catheter, can temporarily relieve patient's suffering but with a high incidence of complications. In recent years, the constant progress of tissue engineering technology provides a new opportunity for the treatment of urethral stricture. However, graft vascularization, local inflammation and recovery of smooth muscle function still hamper the urethra reconstruction using a tissue engineering method. In this study, the adipose derived stem cells (ADSCs) based “micro-tissues” and smooth muscle cells are prepared into suspension with thermo-sensitive chitosan-collagen hydrogel. The liquid compound will rapidly solidified into “jelly slices” by adjusting the temperature. Then, a "live scaffold" for seed cells can be induced by subcutaneously incubation of the above “jelly slices”. Autologous oral mucosal epithelial cells are expanded in vitro and seed into the “live scaffold” to fabricate a tissue engineering urethra patch. In the patch, the “micro-tissues” secrete a variety of cytokines which are supposed to have vascularization and anti-inflammatory effects; the seeded smooth muscle cells will enhance functional and structural reconstruction of the smooth muscle layer from the inside of the scaffold. Finally, animal experiments are conducted to verified the safety and feasibility of the tissue engineering urethra patch, which will provide theoretical and experimental basis for its future clinical application.

尿道狭窄严重影响患者生活质量，传统治疗方式（如尿道扩张、放置尿管）并发症多，难以从根本上解决患者痛苦。尿道组织工程技术的发展，为尿道狭窄治疗带来新的契机。但是，移植物血管化、局部炎症、平滑肌功能重建等问题，仍是困扰尿道组织工程修复的主要难题。本项目利用温敏性壳聚糖水凝胶，将自体脂肪干细胞聚集而成的“微组织球”和诱导分化的平滑肌细胞混合，制成混悬液。然后，通过温度调节将上述混悬液迅速固化为凝胶状片层，皮下包埋后诱导凝胶片层表面产生可种植种子细胞的“活载体”。将体外扩增的口腔黏膜上皮细胞种植到上述“活载体”上，构建完全自体化的组织工程尿道补片。其中，脂肪干细胞“微组织球”分泌多种细胞因子起促移植物血管化和局部抗炎作用，平滑肌细胞从尿道补片内部有效重建平滑肌层。最后，通过动物实验验证上述尿道补片修复重建兔尿道狭窄的安全性和有效性，为组织工程尿道补片治疗尿道狭窄的临床应用奠定理论和实验基础。

背景：各种原因（导尿操作、骨盆骨折或感染）引起的尿道狭窄通常需要尿道重建术来恢复尿道的连续性，临床上常采用自体组织（如颊粘膜或包皮）进行尿道重建，但此类自体材料来源有限，因此，通过组织工程来构建人工尿道，成为解决尿道重建材料缺乏问题的重要手段。近年来，三维生物打印（3D生物打印）在组织工程领域得到广泛应用，为构建组织工程尿道提供了新的思路。.内容：在本研究中，利用了添加了人转化生长因子（transforming growth factor β1, TGF-β1）的诱导培养基诱导hADSCs定向分化为平滑肌细胞的方法，并提升诱导后的hADSCs在3D生物打印组织块中的细胞活力。进一步我们将利用诱导后的hADSCs与3D生物打印相结合，以组织工程手段构建人工尿道，通过动物皮下包埋孵育验证体内其体内变化，并借助尿道缺损模型中验证其有效性。.结果：在诱导3天后，hADSCs微组织球（microtissues， MTs）组的平滑肌特异性标志物αsmooth muscle actin（α-SMA）和Smoothelin的表达量均显著高于贴壁培养hADSCs组。活死细胞染色提示在打印后不同的时间节点，MTs组的存活细胞数比hADSCs组更多（平均存活细胞率为88.16%±3.98%和61.76%±15%），CCK-8检测提示MTs组细胞活力在打印后快速恢复至较高水平。皮下包埋1周后，HE和masson三色染色提示MTs组在体内仍然能够保持其大体形态，周围有血管样结构形成，并且形成了较多的肌纤维和少量的胶原纤维；而hADSCs组则变为圆形，周围缺乏血管样结构。免疫组化染色提示诱导后MTs在体内仍表达平滑肌特异性标志物α-SMA和Smoothelin。免疫荧光染色提示MTs组在体内形成了环状的新生血管结构，且在种植尿路上皮细胞后，表面形成了连续的尿路上皮层。将皮下孵育的3d打印补片表面种植尿路上皮细胞后进行尿道缺损修复，发现短期内可恢复尿道的连续性，然而该方法修补后尿道的尿瘘及尿道狭窄发生率较高。.意义：将悬滴诱导培养与3D生物打印结合，并采用裸鼠皮下包埋孵育并种植尿路上皮细胞的方法，我们构建了组织工程化人工尿道，通过相应的实验观察了其中的种子细胞形态，检测了种子细胞存活状况和细胞表型等指标，但其在大动物尿道损伤修复中的安全性及有效性仍需更大样本量研究进行验证。