RIPK1调控的NF-κB活化在卵巢癌发生发展中的作用研究

卵巢癌是女性生殖系统三大肿瘤之一，严重威胁妇女健康和生命。RIPK1是多条细胞信号转导通路的重要枢纽因子，可能通过介导NF-κB参与致癌剂等诱导的细胞恶性转化，在调控细胞存活与凋亡中起着关键作用。课题组前期研究了NF-κB重要亚基p50编码基因NFKB1启动子区功能性SNP及RIPK1基因两个Tag SNP，发现这3个SNP位点等位基因频率及基因型频率分布在卵巢癌组与正常对照组间有显著差异。本研究拟从DNA遗传变异、mRNA和蛋白表达、蛋白亚细胞定位等角度，深入研究RIPK1与卵巢癌发生发展的关系及其机制；采用质粒转染和RNA干扰，分别使RIPK1高表达与被抑制，研究其对凋亡的影响和对NF-κB活化的影响。本研究最终目的是明确RIPK1与卵巢癌发生发展的关系，探明RIPK1对卵巢癌细胞凋亡的影响，以及通过NF-κB调控凋亡的作用机理，探索干预RIPK1表达调控抑制卵巢癌发生发展的新途径。

卵巢癌是女性生殖系统三大肿瘤之一，严重威胁妇女健康和生命。RIPK1在细胞生存或死亡信号调控通路中发挥着关键。本研究采用PCR-RFLP方法，在319例EOC及376例对照样本中对RIPK1基因Tag SNP位点进行了研究。结果表明：rs9392453的C等位基因增加EOC发病风险，CC基因型携带者患EOC风险增加2.27倍；rs6907943-rs9392453组成的CC单倍型患EOC风险增加2.56倍，而CT单倍型患EOC风险降低0.44倍；SNP rs6907943为EOC患者预后的影响因素，AC杂合子EOC患者复发风险降低；rs6907943位点AC杂合子显著降低早发型EOC总体死亡率。EOC血浆RIPK1表达水平明显高于正常对照组，而外周血白细胞中RIPK1基因mRNA表达显著降低。IHC检测结果发现癌组织中RIPK1表达显著高于对照组织。在EOC患者中新发现RIPK1基因突变位点：RIPK1 mRNA：A1577G（蛋白D526G突变）。构建了野生型（WT）、D526G突变型以及shRNA干扰质粒并转染SKOV3细胞，RNA-Seq筛查各组细胞间差异表达基因，qPCR及Western blot检测分析。研究结果发现各质粒分别转染SKOV3细胞24h后，各组间多个基因表达显著差异：shRNA抑制RIPK1后，IL1R1及TNFSF10等多个基因表达下调，细胞凋亡通路显著改变；D526G突变型质粒转染后，p53等多个通路基因显著改变，且转录因子TAF3表达显著上调，而TAF3促进基因转录，发挥抗凋亡作用，因此，D526G突变还可能通过上调TAF3表达，促进多种靶基因表达，抵抗细胞凋亡，促进肿瘤发生发展；差异表达基因还涉及多个lncRNA及肌动蛋白细胞骨架调控等通路。WST检测细胞增殖，发现D526G显著促进SKOV3细胞增殖，而shRNA抑制RIPK1后，细胞增殖显著降低。Western blot检测结果表明WT及D526G均促进NF-κB表达，RIPK3表达降低；shRNA抑制RIPK1表达后，RIPK3上调，NF-κB下调，提示RIPK1及其D526G突变可能通过NF-κB信号通路促进EOC发生发展。本研究首次在EOC中发现RIPK1基因D526G突变，并探讨了RIPK1及突变的功能，为EOC发病分子机制研究提供了新的思路与方向。