基于金纳米荧光能量转移和核酸适体构象开关的重金属检测新方法研究

The poor stability and low sensitivity still exist in determination of multiple metals (lead, cadmium and arsenic) based on functional nucleic acid molecular as recognition. In this project, 1) based on the specific target molecules induced aptamer conformational switch to form G-nanobeacon and nano G-quadruplexes, a stable, sensitive, and high selective biological sensing method for simultaneous determination of lead and cadmium will be developed by using the AuNPs fluorescence energy transfer (AFET); 2) based on designing the short-sequence arsenic aptamer and integrating with the AuNPs signal amplification technology, a ultrasensitive color sensing method for determination of arsenic will be developed by monitoring the changes of visiable light signals caused by arsenic-nucleic acid aptamer inducing the aggregation of AuNPs. Furthermore, the circular dichroism spectras are used to explore the mechanism of heavy metals induced DNA aptamer conformational switch and AFET, as well as the effect of aptamer type and length on the stability of AuNPs. These will not only provide the technique assistance for heavy metals monitoring and human health risk assessment, but also the new contents for biological sensing determinations at the same time based on aptamer.

以功能化核酸为识别分子的多种重金属（铅、镉、砷）检测方法尚存在稳定性较差和灵敏度较低等缺陷，本课题①以靶分子高特异性识别行为诱导核酸适体构象开关，形成纳米信标和纳米G-四链体，通过金纳米荧光能量转移（AuNPs fluorescence energy transfer, AFET）构建稳定、灵敏、高选择性铅镉同步检测的生物传感方法；②有效设计新型砷核酸适体，结合金纳米信号放大技术，监测砷-核酸适体致金纳米聚集所引起的可见光信号变化，构建超灵敏砷比色传感方法；采用圆二色谱等技术深入探讨核酸适体构象开关机理、AFET机制和核酸适体-金纳米作用机制，重点研究核酸适体类型和长度对AuNPs稳定性影响，为重金属监测和人类健康风险评估提供技术支持，为核酸适体生物传感多事件同步检测提供新内容。

以功能化核酸为识别分子的多种重金属（镉、汞、银、铅、等）检测方法尚存在稳定性较差和灵敏度较低等缺陷，本课题在前期研究基础上，开展了以下研究内容：1）构建稳定、灵敏、高选择性镉检测的生物传感方法：①以靶分子高特异性识别行为诱导镉核酸适体构象开关，以荧光染料sybr green I作为信号报告分子，在最优的实验条件下，适体传感器表现出良好的线性范围，10.0 nM 到 2.0 μM，检测线低至3nM，这比环境保护总署规定的应用水中镉最大污染浓度更低，且在实际样品检测中不需要任何样品前处理步骤。②设计镉功能化核酸适体（GCDSA），Cd2+可能会操纵GCDSA的结构转换以形成活性G-四链体DNAzyme，DNAzyme催化催化H2O2氧化负二价的ABTS2-成正一价的自由基ABTS•+，导致反应体系吸光度值随着镉浓度增加而增加增加。镉浓度0.5~323 nM浓度范围内， 线性方程为ΔA=0.002C (nM) +0.162 ，R2=0.962； 在323~1000 nM浓度范围内，线性方程为 ΔA=0.00005C (nM) +0.769，R2= 0.988，检出限为0.15 nM。本方法通过干扰试验试验了10 uM K+, Ag+, Na+, Ni2+, Cr3+, Hg2+, Zn2+, Mg2+, Ca2+和Ba2+均不干扰测定。2）基于金纳米的荧光共振能量转移及在汞检测中的应用：建立了5种基于金纳米的有效荧光共振能量转移系统，罗丹明6G和荧光素钠被猝灭效率接近100%，吖啶橙，署红B，和藏红T猝灭效率分别为89%，60%，55%，紫外可见光谱和荧光光谱被用来解释荧光猝灭的机制，发现金纳米的吸收光谱和荧光染料的荧光光谱有不同程度的重叠，表明高效的荧光共振能量转移可能是荧光猝灭的机制，利用罗丹明6G和金纳米荧光能量转移系统成功建立了灵敏低简便的汞检测新方法，检测线为0.13nM，线性方程为ΔF = 27.05c (nmol L-1) -79.88，回归系数为0.9954。本方法具有较高的灵敏度，且方便简单，不需要复杂昂贵的仪器设备。3）基于多功能核酸适配体探针荧光猝灭法检测镉和银；4）基于脱氧核酶和滚环扩增技术荧光法测定铅离子；5）专利：一种基于纳米界面能量转移的邻苯二胺检测方法；7）上述检测方法的机制研究，特别是功能化核酸与靶分子作用机制研究，为其他类似分析方法设计