低氧微环境下lncRNA-HOTTIP调控miR-101/ATG4/自噬轴促进舌鳞癌相关成纤维细胞活化的机制研究

Hypoxia is an important feature of tumor microenvironment, which determines its biological characteristics. We have previously demonstrated that cancer associated fibroblast (CAF) is the major component of tumor microenvironment in tongue squamous cell carcinoma (TSCC). CAF promotes tumor growth and metastasis via SDF1 secretion. In addition, both HIF1α expression and CAF amount are increased in TSCC, which are correlated to the poor prognosis of TSCC patients. Hypoxia activates normal fibroblast into CAF. However, the mechanism underlying hypoxia regulating CAF activation remains obscue. Our preliminary experiment data indicated that hypoxia activates autophagy in normal fibroblast, as well as increased expression of HIF1α, lncRNA-HOTTIP and ATG4, but decreased miR-101 expression. Target gene prediction software further demonstrated that miR-101 is specific binding with both HOTTIP and ATG4 segment. Accordingly, we propose a scientific hypothesis: hypoxia activates HIF1α and up-regulates HOTTIP expression, which competes with miR-101 and further activates ATG4 mediated autophagy, leading to CAF activation. In this project, we intend to interfere HOTTIP expression, investigate its function in regulating autophagy activation and CAF activation, and explore the molecular mechanism of HOTTIP interaction with ATG4 in vitro and in vivo. Then we will correlate expression of HOTTIP with clinical pathology and prognosis of TSCC patients. This project will provide a new target for the treatment of TSCC.

低氧是肿瘤微环境的重要特征，影响肿瘤生物学特性。我们前期已证实：癌相关成纤维细胞（CAF）是舌鳞癌微环境中主要细胞，分泌SDF1促进肿瘤生长转移。舌鳞癌标本中HIF1α表达与CAF数量均增加，与患者预后相关；此外，低氧环境可诱导CAF活化。那么，低氧对CAF活化的调控机制是什么？预实验发现，低氧促进成纤维细胞自噬激活，HIF1α、lncRNA-HOTTIP与ATG4上调，miR-101下降；同时，miR-101与HOTTIP、ATG4均有特异结合位点。据此我们提出假设：低氧激活HIF1α并上调HOTTIP，后者作为ceRNA竞争性结合miR-101，导致ATG4升高、自噬激活、CAF活化。本项目拟干预HOTTIP表达，在体外模型中探索HOTTIP对低氧激活自噬、活化CAF的调控功能，阐明HOTTIP与ATG4的作用机理，检测HOTTIP与临床病理、患者预后的关系，为舌鳞癌的治疗提供新靶点。

低氧是肿瘤微环境的重要特征，影响肿瘤生物学特性。本研究中，我们发现低氧可促进正常成纤维细胞（NFs）向癌相关成纤维细胞（CAFs）样成纤维细胞的转化，这些活化的成纤维细胞获得了与CAFs相似的肌成纤维细胞标记物表达，并通过升高的基质细胞衍生因子-1（SDF1）分泌对TSCC具有恶性功能。低氧诱导的HIF-1α促进NFs转移，但不促进肌成纤维细胞的分化。然而，低氧诱导的自噬流可抑制肌成纤维细胞分化。此外，SIS3可抑制了低氧诱导肌成纤维细胞分化。重组TGF-β1可挽救低氧条件下ATG7沉默抑制的肌成纤维细胞分化。据我们所知，这是第一个证明低氧诱导的自噬而不是HIF-1α通过TGFβ1/Smad3信号轴诱导肿瘤中的肌成纤维细胞分化的报告，并且TGF-β1抑制剂SIS3与自噬抑制剂的联合代表了治疗舌癌患者的一个有希望的策略。.此外，我们进一步研究了CAFs通过激活细胞自噬诱导舌鳞癌细胞顺铂抵抗，发现CAFs促进舌鳞癌细胞顺铂化疗抵抗，CAFs共培养下顺铂激活舌鳞癌细胞自噬相关蛋白表达，CAFs共培养下顺铂激活舌鳞癌细胞自噬流，CAFs共培养下CQ促进舌鳞癌细胞顺铂化疗敏感性，敲低Beclin 1可抑制CAFs共培养下舌鳞癌细胞顺铂抵抗及自噬激活。同时，我们也探讨顺铂耐药细胞株中CXCR4表达明显高于亲本细胞株，通过小干扰RNA敲低CXCR4表达后可明显增强舌鳞癌细胞的化疗敏感性、促进舌鳞癌细胞凋亡、抑制其增殖，并通过降低cyclin D1和p-AKT，上调p-caspase-3和Bax起作用。在本项目基础上，也证实了lncRNA-HOTTIP在低氧诱导人舌鳞癌细胞上皮-间质转化过程中的作用。.最后，我们也进一步研究了放射性纤维化在颌骨放射性骨坏死（ORNJ）发生发展中的作用，发现放疗可促进成纤维细胞活化，并释放外泌体抑制骨髓间充质干细胞成骨分化，这些外泌体介导了miR-23a的传递，并进一步调节了miR-23a/CXCL12轴在骨髓间充质干细胞中的表达，为ORNJ的临床治疗提供新的思路。同时，我们也分析了钛表面改性中，miR-23a通过靶向CXCL12在纳米钛表面培养的BMSCs成骨分化中起着至关重要的作用，这可能为骨整合提供新的临床治疗方法。