应用脂肪干细胞联合微囊聚合技术重建组织工程尿道的实验研究

Building of the tissue-engineered urethra with functional epithelial layer and muscular layer is the effective way to prevent urethral stricture, urethral diverticulum, and urinary fistula in urethral reconstruction research. In our earlier study of reconstructing the full-thickness urethra with keratinocytes and smooth muscle cells in the traditional way, we found that it was difficult for the smooth muscle cells to infiltrate into the scaffold for the purpose of reconstruction of muscular lumen. So, epithelial-differentiated adipose-derived stem cells (Epith-ASCs) and myoblast-differentiated adipose-derived stem cells (Myo-ASCs) have been picked for building of the new type of composite biological scaffold closed to normal urethra by fusing microcapsules technology. Histological analysis, cell and molecular biology tests, retrograde urethrograms, organ bath study, and mechanical evaluation on the biological scaffold would be performed before and after substitution urethroplasty, for the purpose of investigating whether the composite biological scaffold could slove the difficulty of smooth muscle cells infiltrating into the scaffold, and reduce the incidence of postoperative complications.

组织工程尿道重建研究中，构建具功能性上皮及肌层结构的仿生尿道支架，是防止术后坍塌、挛缩，进而造成尿道狭窄、憩室，及尿瘘等并发症的有效手段。课题组前期利用上皮细胞及平滑肌细胞双面复合方式构建全层尿道的过程中，发现体外培养阶段及回植术后肌细胞向支架内部移行困难，无法满足全层尿道功能性重建的目的。对此，本项目拟采用前期研究中获得的成肌化脂肪干细胞（Myo-ASCs）、上皮化脂肪干细胞（Epith-ASCs），通过微囊聚合技术介导Myo-ASCs、Epith-ASCs直接参与生物支架组装，构建接近正常尿道肌层及上皮结构的仿生支架，通过回植前后组织学、分子生物学、影像学，肌束器官浴槽实验及支架相关机械力学等检测方法对尿道重建进行综合评价，以期改进传统支架成肌细胞向深部移行困难的缺陷，从而降低术后狭窄等并发症的发生率，为今后的尿道重建工作提供理论基础和实验依据。

尿道狭窄疾病作为长期困扰泌尿外科医师的棘手难题，以往临床上我们多采用膀胱黏膜、包皮皮瓣、口腔黏膜进行狭窄段的替代重建，但自体组织材源有限及二次手术创伤的问题限制了该术式的进一步应用。近年来，尝试通过组织工程技术构建具功能性上皮及肌层结构的仿生尿道支架作为替代材料进行尿道损伤的修复重建，成为研究者们致力的方向。课题组在前期利用上皮细胞及平滑肌细胞双面复合方式构建全层尿道的过程中，发现回植术后肌细胞向支架内部移行困难，无法满足全层尿道功能性重建的目的。对此，课题组了采用前期研究中获得的成肌化脂肪干细胞（Myo-ASCs）、上皮化脂肪干细胞（Epith-ASCs），通过微囊聚合技术介导细胞直接参与生物支架组装，构建接近正常尿道肌层及上皮结构的仿生支架，回植术后组织学检测提示实验组M-GC-E组（M-GC-E生物支架回植组）及M-BAMG-E组（BAMG双面复合成肌化干细胞、上皮化干细胞回植组）术后1月可见尿道腔面出现单层上皮细胞爬行，术后6月腔面上皮层覆盖较1月时更为显著，局部出现复层上皮结构；在M-GC-E组，术后1月及6月腔面下方的肌层结构对比M-BAMG-E组及对照组BAMG组（单纯BAMG支架回植组），生长规则且更致密。同时，Western blot检测提示术后6月M-GC-E组的α-SMA蛋白表达高于M-BAMG-E组，CK19蛋白表达与M-BAMG-E组接近，且这两组的α-SMA，CK19表达均显著高于对照组BAMG组。术后应力学检测提示M-GC-E组的抗拉强度略低于M-BAMG-E 组及BAMG组，弹性模量及断裂伸长率各组间差异无明显统计学意义，证明M-GC-E生物支架具备应用于组织工程尿道重建所需的机械强度及力学要求。研究证实，通过M-GC-E生物支架的构建，能够在体内环境下促进尿道修复部位的上皮组织再生及肌性管腔的构建，有效缓解尿道重建术后尿道狭窄，尿瘘等并发症的发生。