大肠埃希菌中PNPase调控持留菌形成的机制研究

In clinical setting, persister bacteria frequently cause post-antibiotic relapse and are underlying lengthy therapy. The exact mechanisms of persister formation are still unclear. Through the study of persister-specific front-line tuberculosis drug pyrazinamide (PZA), we have found that the special mRNA degradation pathway (trans-translation) is critical for persister survival. But so far, no systematic research has been carried out on common mRNA degradation pathway. Polynucleotide phosphorylase (PNPase) is a major component of RNA Degradosome , which plays a key role in mRNA degrading process. In this proposal, we propose to investigate the role of PNPase in the persister survival and virulence , and clarify the exact mechanisms involved in persister formation. Specifically, we will study the viability of pnp mutant after the exposure of various stresses or antibiotics; compare the pnp gene expression levels between persister cells and normal cells; assess the effects of PNPase on persistence, virulence and antibiotic clearance in animal models; compare changes in genes expression of PNPase mutant in transcriptome and proteome level. This research will clarify the important influence of PNPase in persister survival, and shed new light on mechanisms by which PNPase contributes to persister formation, and provide validated new targets for developing a new generation of persister antibiotics for more effective treatment of persistent bacterial infections.

细菌持留感染导致疾病反复发作，久治不愈，但其确切机制尚不清楚。mRNA的降解途径可能在持留细菌形成中发挥重要作用，课题组前期研究发现抗结核药物吡嗪酰胺可抑制结核分枝杆菌mRNA通过反式翻译的特殊降解途径发挥作用，本课题我们将在大肠埃希菌中，对mRNA一般降解途径中的关键基因调控细菌持留形成作深入研究。多核苷酸磷酸化酶（PNPase）是RNA降解体的主要成分，在mRNA一般降解过程中发挥关键性的作用。我们拟通过研究pnp基因敲除株在不同压力条件处理后的存活能力，及在转录组、蛋白组水平上基因表达的变化；比较正常细菌和持留菌中pnp基因在各种应激条件下的表达差异；研究动物模型中PNPase对大肠埃希菌持留、毒力等方面的功能，来明确PNPase在持留菌存活和毒力中发挥的作用。通过本研究能够明确PNPase在持留菌存活的重要作用，阐明其调控持留菌形成的机制，为研发持留菌新型抗生素提供靶标。

细菌的持留现象已被研究多年，尽管很多基因及通路被报道与其形成有关，但具体的机制仍然不为人知。本研究，我们利用大肠杆菌作为研究模型，确认了多核苷酸转核苷酰酶（PNPase）参与持留菌的形成。我们成功构建了pnp基因缺失株和回补株，并检测他们在三种不同抗生素及压力条件下的敏感性。结果显示，与野生株W3110相比，pnp缺失株对抗生素和压力条件更加敏感，与此同时，回补株对抗生素压力的耐受特性也出现回复。我们做了pnp敲除株和野生株W3110的转录组测序（RNA-seq），结果显示，与野生株相比，缺失株中存在242个基因出现差异表达（166个基因上调，76个基因下调）。对上调的基因进行KEGG通路分析，显著富集的通路为代谢和毒力相关通路，并且受到全局调控因子CRP蛋白的正向调控。并且，在稳定期早期，pnp缺失株中crp基因的转录水平上升了3.22倍。通过我们进一步对细菌内部代谢活动的及pnp和crp基因缺失株的持留特性和crp基因的转录活性研究，揭示PNPase操纵子在转录前水平，靶向作用于crp转录本的5‘端非编码区，控制细菌的代谢，从而影响细菌持留菌的形成能力。本研究有助于我们理解持留菌形成的机制，为持续性感染提供新的有效的药物靶点奠定了基础。