delta113p53特异性拮抗p53介导的细胞凋亡分子机理研究

肿瘤抑制基因p53通过监测细胞受损程度来控制细胞的生与死，确保机体的遗传稳定性。最近我们在斑马鱼中发现p53存在着异构体?113p53。进一步研究揭示?113p53 是p53目标基因，通过改变p53下游基因的表达，特别是特异性提高抗凋亡基因Bcl2L的表达，来阻止细胞凋亡，但其作用的分子机理还不清楚。?133p53(人)在很多癌症细胞中过量表达，不知是否是肿瘤基因。本项研究目标如下：.1、通过免疫共沉淀方法，鉴定?113p53和p53是否能形成异源多聚体。证明此异源多聚体是不是?113p53行使功能所必需的。.2、采用染色质免疫共沉淀法来证实此异源多聚体是否直接影响p53对其目标基因的驱动性。.3、构建转基因斑马鱼过量表达?113p53，观察是否生长肿瘤，证明?113p53是否是肿瘤基因。.研究结果将会进一步揭示?113p53的功能及其调节p53的分子机制，并对癌症治疗有重要的指导作用。

根据项目执行中，起得的进展和面临的问题，我们对实验计划作了适当的调整。从以下三个方面来完成本项目：1）△113p53与p53形成复合体是否是△113p53拮抗细胞凋亡的所必需的；2）△113p53调控转录分子机制。申请书列出的目标基因p21，bcl2L在斑马鱼基因组中的测序未完成，难以克隆启动子。同期我们发现p53抑制，△113p53促进DNA双链断裂修复基因rad51的表达，所以调整到通过对rad51启动子研究来揭示△113p53的转录功能；3）由于用CMV-△113p53未能得到转基因鱼，我们构建了可诱导表达△113p53转基因鱼和特异性敲除△113p53突变体，研究其对发育和肿瘤发生的影响。.内容1：构建只识别全长p53抗体和识别p53和△113p53的抗体，证明p53和△113p53在体内形成复合体。通过对△113p53的多聚体结构域进行定点突变，构建了6个突变体，其中两个突变体不能与p53结合，发现只有这两个突变体不能拮抗p53介导的细胞凋亡，从而证明，△113p53与p53形成杂合复合体是△113p53特异性拮抗p53介导的细胞凋亡的所必需的，该成果正在投稿中。.内容2：构建rad51的启动子启动egfp表达载体，发现它能够真实反应体内rad51的表达，软件分析找到rad51启动子中含有两个新的类型p53结合域，研究表明一个是p53抑制rad51表达所必需的，另一个是△113p53促进rad51表达所必需的。ChIP和EMSA 表明，P53优先结合到第一位点，△113p53只结合到第二位点。从而发现了p53和△113p53调控基因表达的新机制。部分成果已发表在Journal of Genetics and Genomics (2012, 39:489-502)，余下成果正在投稿当中。.内容3：用CMV-△113p53过表达载体来构建转基因斑马鱼，但从1000多条f0代中，未能筛选到转基因斑马鱼。这可能是由于过表达△113p53有致死作用。于是我们改变策略，用四环素诱导的表达载体来构建△113p53转基因斑马鱼，现已获得两个转基因系；并且还通过TALEN的方法，对△113p53的启动子的关键区域进行突变，获得专一性的敲除△113p53斑马鱼。进一步的实验正在进行当中。.本项目已发表SCI论文一篇，另两篇正在投稿，结论：完成任务。