蛋白激酶D1对PRC1复合体亚基CBX8的磷酸化修饰在细胞衰老中的作用和机制研究

Epigenetic regulation plays critical role in mediating cellular senescence and senescence-associated secretory phenotype (SASP).Among these, the polycomb repressive complexes (PRC) have crucial role in regulating cell senescence via modulation of its target genes INK4a/ARF/INK4b transcription. The subunits of PRC are subjected to various modification such as phosphorylation and ubiquitination, all of these modifications have great impact on the structure and function of PRC. Our preliminary data show that protein kinase D1 (PKD1) can bind to the PRC1 subunit CBX8 and phosphorylate it. Moreover, PKD1 also interacts with the other subunits of PRC1. Therefore, the main goal of this project is to explore the CBX8 phosphorylation by PKD1: (1) Identify the phosphorylation site of CBX8 by PKD1. (2) Investigate the effect of CBX8 phosphorylation on its stability, on the structure and function of PRC1, and on the transcriptional regulation of INK4a/ARF/INK4b gene locus, as well as on the cell senescence. Therefore, this project may expand our knowledge of PKD1, identify the new modification and function of PRC1 subunits, and find the novel mechanism in mediating cellular senescence.

表观遗传调控在细胞衰老和与之关联的衰老相关分泌表型中起着关键作用，这其中多梳蛋白抑制性复合物对INK4a/ARF/INK4b基因簇（编码p16, p15和p14）的表达调控在细胞衰老中起着重要作用。PRC复合体各亚基也受到多种修饰作用的调控，这些修饰对PRC复合体的结构和功能有重要影响，磷酸化的修饰是其中之一。我们前期的工作发现蛋白激酶D1（PKD1）能与PRC1复合体中的CBX8亚基相互作用并能使之磷酸化，PKD1也能与PRC1复合体中的其它亚基相互作用。本项目拟重点研究PKD1对CBX8的磷酸化修饰：（1）鉴定出磷酸化位点；（2）阐明CBX8的磷酸化修饰对自身蛋白稳定性的影响、对PRC复合体结构和功能的影响、对INK4a/ARF/INK4b基因簇表达的影响以及在细胞衰老中的作用。因此，本项目对拓展PKD1的功能、探究PRC1亚基新的修饰对其功能的影响以及发现细胞衰老新机理都有重要作用

表观遗传调控在细胞衰老的调控中起着关键作用，这其中多梳蛋白抑制性复合体PRC对INK4a/ARF/INK4b基因簇（编码p16, p15和p14）转录的表观遗传调控在细胞衰老中起着重要作用。PRC复合体由PRC1和PRC2两个复合体组成。组成PRC复合体的各亚基自身也受到多种修饰作用的调控，这些修饰对PRC复合体的结构和功能有重要影响，而磷酸化修饰就是其中之一。目前对PRC1复合体中的亚基之一CBX8的磷酸化修饰及其功能的研究很少，几乎未知。.根据本项目的研究计划，我们主要围绕PKD1对CBX8的磷酸化修饰以及这种修饰在细胞衰老中的作用开展了研究，主要研究内容和取得的主要研究结果如下：.1、研究了PKD1与CBX8之间的互作关系；PKD1对CBX8的磷酸化修饰作用。我们发现：PKD1与CBX8能够互作；PKD1能够磷酸化修饰CBX8的Ser和Thr位点并鉴定出了3个磷酸化位点；在血清刺激、细胞周期变化、癌基因Ras诱导的细胞衰老过程中CBX8也能被PKD1磷酸化。.2、研究了PKD1磷酸化修饰CBX8对CBX8表达水平和蛋白质稳定性的影响及其机制。我们发现：PKD1对CBX8的磷酸化修饰降低了CBX8的蛋白质表达水平；CBX8不同位点的磷酸化修饰对CBX8蛋白质稳定性有不同的影响；其机制是通过蛋白酶体的降解途径。.3、研究了PKD1磷酸化修饰CBX8对PRC1复合体结构稳定性和功能的影响。我们发现：PKD1对CBX8的磷酸化修饰降低了H2AK119ub1和H3K27me3的水平并改变了多个CBX8下游靶基因如p16的表达水平；PKD1对CBX8-Ser311位点的磷酸化修饰可能破坏PRC1复合体的完整性。.4、研究了PKD1磷酸化修饰CBX8在细胞衰老中的作用及机制。我们发现：PKD1对CBX8 的磷酸化修饰加速了细胞衰老，而不能被磷酸化修饰的CBX8突变体则延缓了细胞衰老；其机制是PKD1对CBX8的磷酸化修饰导致了INK4a-ARF-INK4b基因簇的转录激活，从而促进细胞衰老。.综上，本项目所获得的主要研究结果揭示了PKD1对CBX8的磷酸化修饰作用以及这种修饰对PRC复合体结构和功能的影响，揭示了PKD1通过磷酸化修饰CBX8能够在表观遗传水平上调控细胞衰老，因而具有较好的创新性和重要的科学意义。.