以食蟹猴为灵长类动物模型解析原始生殖细胞极早期发育的决定性因子及其时序调控特征

As the precursor of sperm and egg, primordial germ cells (PGCs) play very important roles in life cycling, perpetuating genetic as well as epigenetic information. However, due to limited number of early stage PGCs and available techniques, people know very little about the early stage of PGC formation and development, especially the period of very early 7 weeks, from primary PGC formation in post-implantation two weeks embryos to its migrating towards gonadal ridge. To overcome the limited samples and ethics restriction in human early embryos study, we combine the in vitro and in vivo studies of animal model of macaca fascicularis, and focus on very early 7 weeks of PGC development, to reveal developmental-stage-specific features of transcription patterns and histone H3K4me3 and H3K27me3 modifications. Then, we analyze high-throughput sequencing data of transcriptome and histone ChIP-seq to uncover the key hub genes, signaling pathways and functional modules and their dynamics. Based on these results, we can further optimize the in vitro PGC specification system to improve its efficient. In summary, this study will shed light on safety evaluation of assisted reproduction technologies, cell replacement therapy of infertility and miscarriage, and promote the clinic application of stem cells and development of translational medicines in the field of reproductive health.

作为能发育成精子或卵子的始祖细胞，原始生殖细胞（Primordial germ cells, PGC）在生命繁衍、遗传信息传递中发挥着关键作用。目前，人们对于灵长类PGC极早期发育过程，尤其是胚胎着床后约第二周PGC初步形成至PGC向生殖嵴迁移的前7周知之甚少。本项目拟结合食蟹猴体外细胞模型及体内动物模型，克服人类早期胚胎研究伦理限制及材料获取的困难，重点聚焦PGC发育前7周这个重要时期，首先揭示该过程中的转录调控、活化性H3K4me3及抑制性H3K27me3组蛋白修饰图谱变化;并在此基础上，通过测序数据分析，阐明该过程的驱动基因、关键信号通路、功能模块及它们的时序调控特征；进而以之为理论基础进一步优化灵长类多能干细胞向PGC的体外分化系统。预期结果将为辅助生殖技术的安全性评估、不孕不育、胚胎停育等疾病的细胞替代性治疗提供理论指导，促进多能性干细胞在生殖疾病相关领域的运用和转化。

作为人类及其它众多物种两性生殖细胞的“始祖”，原始生殖细胞(primordial germ cells, PGCs)在维持物种稳定性、生命繁衍和遗传信息传递中发挥着关键作用。在本项目中，我们首先诱导食蟹猴胚胎干细胞向PGC分化，在该过程的不同阶段(第0天、第2天与第4天)分别进行单细胞转录组测序(scRNA-seq)，我们共获得食蟹猴PGC分化day0、day2、day4三个时间点各91、55、66个单细胞样本。我们进一步获取了食蟹猴体内极早期PGC数据，其中ePGC(day20-day23)、gPGC(day36-day55)单细胞数量分别为23和25个，所有样本均为胚胎着床后2-8周左右。比较分析发现，我们培养的食蟹猴体外分化PGCs与食蟹猴体内PGCs具有很好的一致性。进而，我们对食蟹猴PGC基因组中活化性H3K4me3及抑制性H3K27me3组蛋白修饰进行了分析，并在原申请书基础上增加了H3K27ac数据。在全基因组范围内，食蟹猴H3K4me3修饰主要发生在转录起始位点附近，H3K27ac在基因远端存在更强的富集，共计2422个基因存在H3K4me3与H3K27me3共同修饰的bivalent domain。进一步的，我们基于WGCNA分析鉴定该过程中的基因模块，获得了与食蟹猴PGC分化过程密切相关的17个重要特征性功能模块。最后，我们绘制了与食蟹猴PGC特化高度相关的决定性因子与关键信号通路，其中包括GATA3、TFAP2C、SOX17、BLIMP1、NANOS3等核心成员。以之为基础，可以进一步优化灵长类多能干细胞向PGCs的体外分化效率，并且我们对其中的关键因子GATA3在食蟹猴PGC分化中的功能进行了初步验证。另外，在原申请书的基础上，我们进行了人和小鼠的延展和物种比较，并分别获得了对应于人、猴、鼠的6个核心子网络及其中的关键因子。我们发现BMP与WNT信号通路在3个物种的PGC发育过程中具有很强的功能保守性。本项目的完成加深了我们对于PGC命运决定及其发育机理的精确了解，揭示了灵长类动物生殖细胞的组蛋白修饰、关键因子、转录时序调控、重要功能模块等特征，为后续应用和转化奠定了理论基础。