TIPE2基因修饰人羊膜间充质干细胞诱导免疫耐受促进同种异体心脏移植疗效及机制研究

The biggest obstacle to heart transplantation in patients with end-stage heart disease is immune rejection,Human amnion-derived mesenchymal stem cells (hAD-MSCs)transplantation in the treatment of Allogeneic rejection and Ischemia reperfusion injury and Promote graft survival has a broad application prospect, But the persistence of immune tolerance is not ideal and its application is limited.At present, there is no report on the hAD-MSCs gene modified by TIPE2, and then using the peripheral transplantation combined with thymus injection to induce immune tolerance,The project intends to TIPE2 gene as the breakthrough point, in vitro by gene transfection up-regulated, antibody blocking or gene silencing genes TIPE2 down to study the inhibition on the proliferation of T cells to differentiate and detect the Treg induction and related immune inhibitory factor secretion;by establishing a mouse model of allograft heart transplantation, the hAD-MSCs gene of the receptor was up-regulated or silenced by thymus injection combined with peripheral transplantation In vivo,Expected to induce a more effective and durable chimeric and specific immune tolerance,And the survival time and quality of the donor heart were significantly increased,to explore the cellular and molecular mechanisms associated with the induction of immune tolerance,The study is expected to provide an ideal cell source and target for organ transplantation.

终末期心脏病患者心脏移植面临着最大的障碍是免疫排斥反应，人羊膜间充质干细胞(hAD-MSCs)移植在减轻异基因排斥反应、缺血再灌注损伤、促进移植物存活等方面具有广阔应用前景，但免疫耐受持久性不理想限制了它的应用。目前未见将hAD-MSCs进行TIPE2基因修饰后，再运用外周移植结合胸腺内注射方式来诱导免疫耐受的报道，本项目拟以TIPE2基因为切入点，在体外通过基因转染上调、抗体阻断或基因沉默下调TIPE2基因来研究hAD-MSCs对T细胞增殖的抑制，检测其对Treg的诱导和相关免疫抑制因子的分泌；在体内通过建立同种异体心脏移植小鼠模型对受体进行胸腺内注射结合外周移植上调或沉默TIPE2基因的hAD-MSCs，预期诱导一种更有效持久的嵌合和特异性免疫耐受，而且异体供心存活时间与质量明显提高，分析诱导免疫耐受相关的细胞和分子传导机制，本研究可望为器官移植带来更理想的细胞供源和作用靶点。

同种异体心脏移植后的具体排斥反应及机理并不清楚，导致急慢性排斥反应的病理过程并不相同，所以我们认为不同的疾病时期的微环境不同，导致的愈合也不相同，在急性期，供体心脏存在冷热缺血，恢复血供后，同时存在同种异体排斥反应和缺血再灌注损伤，同时心脏移植后，同时涉及心肌细胞和吻合后大小血管的免疫排斥反应,不同时期，血液循环中的微环境是不一样的，所以急慢性排斥反应的表现也不一样，急性排斥期，全身处于应激状态，补体激活，同时血细胞与同种异体供体心肌细胞接触后，立刻发生识别，启动排斥反应，同时血小板等在损伤的血管内皮附着，引起大小血管的栓塞，供体处于一个排斥加栓塞性病变期，所以急性排斥期，不光是心功能衰竭—由于心肌细胞导致的排斥反应，还有缺血再灌注损伤后，内皮功能障碍及栓塞性病变导致的多因素的一个结果。这与前期我们课题组结果吻合，单纯的抗排斥药物或者抗排斥药物联合干细胞并未实现完全的免疫耐受或者免疫逃逸。到中后期，出现的慢性排斥反应，多是移植物血管病引起，与我们假设是吻合的，后期经过了前面急性排斥期后，在人羊膜间充质干细胞干预下，度过了急性排斥期，后期是一个血管病变，血管内皮细胞损伤后，呈现一个进展性的病变，血管狭窄，平滑肌细胞的增殖，进一步加重了血管的狭窄，引起供体的血供不足。成功进行外源基因TIPE2转染人羊膜间充质干细胞及鉴定，TIPE2转染的人羊膜间充质干细胞和其小鼠受损心肌细体外共培养可以增强可以促进心肌细胞增殖和降低凋亡率。TIPE2可以减少细胞的免疫排斥。qPCR和WB检测结果表明，与空载转染相比，TIPE2转染人羊膜间充质干细胞中p38，ERK和TGF-β的mRNA表达水平降低，同时蛋白表达和磷酸化水平也相对降低，揭示TIPE2过表达可能抑制细胞的免疫反应通过p38/MARK信号通路。