人和食蟹猴的诱导神经干细胞及其在帕金森模型中的应用

The reports of induced pluripotent stem cells (iPSCs) and induced mature neurons (iNs) suggest a possibility to directly reprogram somatic cells into induced neural stem cells (iNSCs). Patient-specific iNSCs may open an avenue to the treatment of neurodegenerative diseases, in that iNSCs may circumvent the ethical issues and immune rejection problems. In our previous work, we have successfully converted murine somatic cells into iNSCs by defined factors; the murine iNSCs can differentiate to electrophysiologically functional mature neurons in vitro and survive transplantation into mouse brains and further turn into mature neurons in vivo. In the current proposal, we will extend this work and attempt to reprogram human and cynomolgus monkey fibroblasts into functional iNSCs by using an inducible system to deliver exogenous factors. Following a series of in vitro and in vivo characterization experiments, we will continue to test the safety and efficacy of human and monkey iNSCs in mouse and cynomolgus Parkinson's disease models, respectively.

诱导多功能干细胞（iPSC）和诱导神经元（iN）的出现提示了也许可以直接将体细胞重编程为神经干细胞（iNSC）。iNSCs可以源于病人自身，所以不存在伦理及免疫排斥的问题，为治疗退行性神经系统疾病开辟了新的途径。我们在前期工作中成功的将小鼠的体细胞通过转入外源因子诱导成神经干细胞；这种iNSCs 可以在体外分化成具有电生理活性的成熟神经元并在移植到小鼠脑内后能够存活并向神经元分化。在申报的课题中，我们将延续这一工作，尝试将人和猴的皮肤细胞通过转入可调控的外源因子，诱导成有功能的iNSCs。在完成一系列的体外和体内鉴定以及因子组合优化的实验后，我们还会在免疫缺陷小鼠的帕金森模型和食蟹猴的帕金森模型中分别验证人源和猴源的iNSC的安全性和有效性。

本项目的研究目标是验证能否通过转入神经发育相关的外源性转录因子将人和食蟹猴的成纤维细胞诱导成为诱导神经干细胞（induced neural stem cells, iNSC), 并对所得iNSC的生物学特性进行鉴定，通过在体移植方式检测其对帕金森病动物模型是否具有治疗作用。根据前期研究成果,首先选定以下11个与神经细胞发育密切相关的外源因子 Ascl1， Hes1， Neurog2， Id1， Brn2， Pax6， Sox2， c-Myc， Klf4， Foxg1和 Tcf3进行后期诱导。实验中发现转入这些神经发育相关的外源因子可以将人的成纤维细胞诱导为iNSC，所得的iNSC表达神经干细胞特异性抗原，并可以分化为神经元和星型胶质细胞，但此种iNSC不能持续增殖，后期应用潜能有限。为提高诱导效率和简化取材过程，起始细胞被调整为外周血中 CD34+的单个核细胞。并选择非整合性载体转入Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc四个因子，促使单个核细胞呈进入重编程的中间状态，通过在特定培养基中加入CHIR99021和SB431542等小分子进行筛选和扩增，最成功终获了得具有良好的增殖能力，能够在体外长期传代培养iNSC。该细胞表达神经干细胞特异性抗原，能够分化成多巴胺能神经元、运动神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞为。为检测该类血液单个核细胞来源的iNSC的在体分化情况和对帕金森病动物模型是否具有治疗作用，拟在下一步研究中将iNSC注射到神经生发区和帕金森动物模型，目前已经完成该帕金森动物模型的制作和鉴定工作。总结上述内容，本项目成功将人成纤维细胞和单个核细胞诱导成为iNSCs。通过调整研究方案，提高了iNSCs的诱导效率并获得了能够稳定增殖的iNSCs细胞系。实验数据表明从外周血来源的CD34+单个核细胞诱导所得的iNSC增殖和分化能力明显优于原方案，且操作更为简单，但该类iNSC的安全性、有效性及在帕金森病和其它神经退行性疾病中的应用前景将在以后的工作中进一步验证。