基于AD新靶点TREM2分子互作的洋金花种子治疗AD的酰胺木脂素类成分发现及作用机制研究

On the basis of the determination on the anti-AD pharmacological effects of Datura metel seeds, a new Biacore system was established the molecular interactions biosensor chip immobilized with the TREM2 receptor proteins as AD new target referring to the Biacore analytic system. Oriented by the binding values of the Biacore system, the systematic separations were developed to split the fractions and constituents, as well as the activity evaluation. The structures of the isolated compounds were confirmed by 1D, 2D-NMR spectroscopy technique. And, the.effective fractions and compounds for curing AD of Datura metel seeds were determined by the pharmacodynamics in vitro and vivo. Combining with the SAMP8 mice model, the LPS-induced original generation microglial cells model, they were utilized to investigate the relative cytokines and proteins levels of neurotrophy, oxidative stress and inflammatory response around the TREM2 receptor proteins. The above was put into effect in order to explore the relationships between the effective fractions, compounds and nerve nutrition, oxidative stress, pathways regulating, to illuminate the pharmacodynamic material basis and action mechanism for the AD treatment of the Datura metel seeds. This research provided the scientific evidence for developing AD treatment new drugs with good effect and intellectual-property rights, and making full use of the non-medicinal part resources of the Datura metel seeds, as well as providing a new pattern and method to investigate other drugs for the AD treatment, even the drugs for other disease.

本项目拟在已确定洋金花种子治疗AD的药理作用基础上，构建基于Biacore分析系统的偶联AD新靶点TREM2受体的分子互作传感片，以分子互作结合程度为导向开展拆分组分和单体成分的分离及活性评价工作；采用1D、2D-NMR波谱学测试技术鉴定单体成分的化学结构，通过体内外药效学实验确定洋金花种子治疗AD的有效组分和成分；结合快速老化痴呆小鼠(SAMP8小鼠)模型、LPS诱导的原代小胶质细胞模型，围绕AD病理过程中与TREM2靶点相关的细胞因子的水平及其表达，探讨有效组分、有效成分两个层次药效物质与神经营养、氧化应激和通路调节的相关性，阐明洋金花种子治疗AD的作用机制。本项目为研制出疗效好、具有自主知识产权的治疗AD新药奠定实验基础，为充分开发利用非药用部位—洋金花种子植物资源提供科学依据，亦为AD治疗药物乃至其他疾病治疗药物的研究和开发提供新模式。

本项目完成了TREM2-SPR靶标活性成分识别系统构建，同时应用靶标活性成分识别系统、UPLC-MS 技术结合参考文献、标准品数据库等形式识别并鉴定洋金花种子的靶标活性成分为4个酰胺木脂素类成分；运用 HP-20 大孔树脂进行成分富集，结合 HPLC 技术明确洋金花种子中 70% 乙醇洗脱组分为酰胺木脂素组分 (LDS)，并利用 Masslynx 采集分析技术以及数据库，参考文献，标准品综合分析确证了富集组分中含有的 27 个酰胺木脂素类成分。同时从洋金花种子有效组分中分离出31种酰胺木脂素类单体化学成分，完成结构鉴定明确化学结构，明确化学结构。 .采用 Sam P8 模型小鼠综合行为学测试以及病理学研究，明确洋金花种子中酰胺木脂素类成分改善了Sam P8 模 型小鼠学习记忆能力；采用WB 以及 ELISA 技术，明确洋金花种子中酰胺木脂素类成分可提高 TREM2/Dap12 蛋白表达，从而调节TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3/caspase-1、PI3K/AKT/PAKT/GSK-3β 以及Nrf2/HO-1 蛋白通路，进而调控神经因子 (GFAP、IBA-1、NPY、NeuN、BDNF、NGF)的释放、炎症指标 (TNFα、IL-6、IL-1β) 的表达，以及氧化指标 (LDH、ROS、SOD、GSH-Px)的变化；通过建立 LPS 诱导的 BV2 神经炎症模型，LDS 可将LPS 诱导 BV2 释放NO降低；同时LDS 显著降低 BV2 神经炎症模型中 iNOS、COX-2 和 IBA-1 蛋白的表达；同时增加 TREM2/DAP12 的表达，并抑制 TLR4 通路和 NLRP3/caspase-1 炎症小体的表达，抑制 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 炎症因子释放，进而证明其抑制神经炎症反应。 .此外，为了完善项目研究的完整性、延伸项目研究深度，开展了洋金花不同药用部位活性成分的定性及定量研究，同时从其他药用部位中分离获得了150余种单体化学成分。.项目相关成果获得黑龙江省科学技术(自然类)一等奖、中国中西医结合学会科学技术二等奖各1项；共发表论文20篇，其中发表SCI论文13篇、中文核心论文4篇、会议论文3篇；培养硕士研究生及本科生共5名。