转运体ABCC4/ABCC5在叶酸拮抗剂耐药现象中的机制研究

Antifolates are commonly used in clinical,drug-resistance and toxicity are the main reason of treatment failure. But molecular mechanism of antifolates drug-resistance is still confuse. .ABC transporters play key role in antifolate efflux, but it is short of systematic research there are few study about their role in antifolates drug-resistance..Our pre-experiments showed that expression of ABCC4,ABCC5 were significant increased in the methotrexate-resistant cells, and the IC50 of other antifolates were also increased significantly，but the machanism still unknown. So our hypothesis are:ABCC4/5 can efflux the antifolates, especially high-dose antifolates and new members of antifolates..The goal of this proposal is to test the hypothesis that these two pumps affect antifolates efflux by using HEK293 cells model,gene delivery mouse model, clinical trial.In this experiments, we will using those technical, such as real time PCR, Western blot, Adeno-associated virus (AAV)-mediated gene delivery, plasmid transfection and so on, to explore the molecular mechanism of ABCC4/5 in antifolates drug-resistance.. We will analyze the molecular mechanism of ABCC4,ABCC5 in the pharmacodymacis and phacokenetics of antifolates. We hope will this research could provide a way to increase the effectiveness of antifolates, and thus increase the cure rate in disease.

叶酸拮抗剂广泛用于临床治疗，耐药和毒副作用是导致疗效不佳的主要原因，但迄今叶酸拮抗剂耐药机制仍不明确。ABC转运体是叶酸拮抗剂排泄中主要转运蛋白，但其在叶酸拮抗剂耐药中的作用缺乏系统研究。我们前期结果显示甲氨蝶呤耐药细胞株中ABCC4、ABCC5表达增加，且对其他叶酸拮抗剂也产生了交叉耐药，但具体机制还需进一步探讨。为此，我们提出假说：ABCC4、ABCC5参与叶酸拮抗剂耐药，尤其是新型叶酸拮抗剂、大剂量叶酸拮抗剂中毒时外排的重要因素。为了验证这一假说，本研究将从HEK293细胞模型、gene-delivery老鼠模型、临床试验等多个层次，采用real time PCR、Western blot、AVV9腺病毒载体感染动物、质粒转染细胞等手段，探讨ABCC4、ABCC5在叶酸拮抗剂耐药中的具体作用机制。本项目将分析ABCC4/5在叶酸拮抗剂PK/PD发挥的作用，为个体化用药提供理论基础。

按照课题任务计划书，本研究将从细胞模型、gene-delivery老鼠模型、临床研究等多个层次，探讨ABC转运体在叶酸拮抗剂耐药中的具体作用机制。课题研究者按照年度计划要点的计划进行，工作内容无调整。目前课题临床部分、细胞实验部分已经完成，完成预期课题目标。.目前该课题发表SCI论文3篇（Plos　one 3.73，AM J RESP CELL MOL，4.23，Pharmacology,1.67），一篇会议论文（circulation，IF=14.7）发表中文论文3篇，均署课题编号。本课题研究研究内容获得2014年度《上海市药学科技奖》三等奖、《上海市医学科技奖》三等奖各一项。培养研究生一名。申请并获得专利3项。多次做大会报告，并获得研究同行的认同。.1. 我们严格按照计划书的计划, 完成了细胞实验。我们在MCF-7细胞中研究了ABC转运体表达对叶酸拮抗剂的细胞内外的转运的影响;在本部分研究中，我们的结果显示，ABCC5直接转运培美曲塞，高表达ABCC5转运体将会使细胞内药物减少而导致细胞耐药。为了进一步在临床患者验证我们的细胞实验结果，本课题组收集临床患者的乳腺癌标本，研究ABC转运体与培美曲塞的转运和耐药的关系。我们收集了22例临床乳腺癌样本甲氨蝶呤、培美曲塞的IC50测定，原代培养，研究ABC转运体的表达与培美曲塞耐药的影响；临床研究结果进一步验证我们的假设。.2.同时，本课题ABC转运体基因多态对甲氨蝶呤的血药浓度和疗效的影响。研究入选112名急性白血病患者，收集病人的入院日期、身高（cm）、体重（kg）、体表面积（㎡）、WBC、N、BPC、Hb、CRP、AST、ALT、BUN、Cr、尿酸、胆汁酸、碱性磷酸酶、GGT、白蛋白、口腔黏膜损害、呕吐、腹泻次数。所有不良反应分级根据2003年代世界卫生组织抗癌药物常见毒副反应分级标准（WHO3.0)评价。.在此部分研究中, 我们筛查转运体ABCG2、ABCC2、ABCC4的基因多态性与儿童急性淋巴细胞白血病治疗中血MTX浓度和毒性的相关性。发现ABCC2-24 C>T突变影响血浆MTX浓度，并与临床的不良反应密切相关。