牛支原体强弱毒株间差异蛋白鉴定及其与毒力相关性研究

Mycoplasma bovis（M.bovis）has been recognized as a major cause of calf pneumonia worldwide. The pathogenic determinants and the pathogenic mechanism of M.bovis are still unclear. To our knowledge , there is no effective strategy for prevention and treatment of this deleterious pathogen. The aim of this study is to identify the differential proteins and find out the correlation between proteins and pathogenicity. Initially, we have screened out differentially expressed proteins using isobaric tags for relative and absolute quantitation（iTRAQ）, followed by Real Time-PCR identification and Western blot. Then, the deletion mutants are constructed according to above research. In this study we will utilise different techniques including liquid scintillation counting assay, flow cytometry，immunohistochemical technique for determining adherence rates of mutants to bovine bronchial epithelial cell, apoptosis of lymphocytes induced by these mutants and virulence to cattle and so on. In view of the above，this study will reveal deep insight of the relationship between differentially expressed proteins and their virulence. Furthermore, it is very significant for illustrating pathogenic mechanism of M.bovis.

牛支原体是一种当前严重危害养牛业的重要病原，能引起牛的肺炎、乳腺炎、关节炎等多种病症。由于其毒力因子不清、致病机理不祥，致使牛支原体病目前仍然缺乏有效的防控手段。申请人及所在课题组前期研究中已获得牛支原体强弱毒力菌株，并采用新型蛋白质组学定量技术iTRAQ初步发现二者间存在28种差异表达的蛋白。本项目拟在前期研究基础上采用Real Time-PCR和Western Blot法对这些差异表达的蛋白进行确认；然后，从中筛选表达量差异显著的基因构建基因缺失突变株；最后，采用液体闪烁计数、流式细胞术和免疫组化等技术，从体外和体内两方面，比较野生型菌株和突变株对牛支气管上皮细胞黏附能力、诱导淋巴细胞凋亡水平及对牛体致病力的差异。深入研究差异表达蛋白在牛支原体致病中的作用及其与毒力的关系，有望获得牛支原体的毒力相关蛋白及其致病分子机理，为新型疫苗研制提供理论依据。

支原体是一种对养牛业有较大危害的病原，在混合感染时，常给养牛业造成更严重的损失。由于对该病原的毒力因子及致病机理缺乏系统的研究，致使该病目前仍然没有有效的防控手段。.本研究以前期iTRAQ获得的牛支原体强弱毒力菌株差异表达蛋白谱为研究对象，对其进行鉴定和研究差异表达蛋白与毒力的相关性。采用RT-PCR验证随机选取的8个差异表达蛋白的基因，结果表明，在强弱毒力菌株中它们在mRNA表达水平上同样存在差异，且上调或者下调趋势与iTRAQ结果相同。同时，选取在强毒株中高表达的14个蛋白进行克隆表达和蛋白纯化，经Western-blot方法，用牛支原体阳性血清筛选出9个新型免疫原性蛋白。为了从蛋白质表达水平上进一步验证强弱毒力菌株中差异蛋白的表达，对iTRAQ结果中3个差异表达和2个非差异表达蛋白基因进行克隆表达和蛋白纯化，并制备单抗和多抗；然后，采用Western blot方法，用制备多抗与等量的牛支原体强弱毒力菌株全菌蛋白进行分析，结果显示蛋白表达量与iTRAQ实验结果一致。.然后，选取具有免疫原性的差异蛋白Mbov_158和Mbov_338进行毒力相关性研究。研究表明2个蛋白在不同菌株中分布具有保守性，蛋白分布在牛支原体的胞质和胞膜中。采用间接免疫荧光结合激光共聚焦显微镜发现这2个蛋白可以黏附胚胎牛肺细胞，且呈现剂量依赖关系，且这种黏附能力可以被抗蛋白的多克隆抗体抑制，表明蛋白的黏附是特异性的。同时采用Dot-blot和Elisa方法，发现2个蛋白能够与细胞外基质成分纤连蛋白发生黏附作用，且呈现剂量依赖性和饱和性关系，是新型黏附相关蛋白和毒力相关蛋白，在支原体致病过程中发挥重要功能。另外，采用转座子随机插入的方法建立2285多株牛支原体基因突变株，经测序后发现有2株是差异蛋白插入突变株。牛支原体强弱毒力毒株感染牛体后外周血淋巴细胞基因表达研究表明，强毒菌株组与空白对照组相比有1892个基因上调，1474个基因下调；弱毒组与强毒组相比有948个基因上调，1308基因下调。强弱毒菌株感染牛体的实验结果表明，强毒菌株表现出明显的临床症状和肺部病理损伤，而弱毒菌株感染后无明显临床症状，肺部组织也没有出现病理损伤，且能够诱导较高的IgG抗体水平。.Mbov_158和Mbov_338两个毒力相关蛋白的发现为牛支原体感染宿主细胞的分子机理研究提供一个新的切入点。.