水貂铜绿假单胞菌强弱毒菌株差异表达基因的鉴定及其与毒力的相关性研究

Pseudomonas aeruginosa is one of the major pathogens of hemorrhagic pneumonia in mink for nearly 50 years, however, the mechanism of its susceptibility to mink remains unknown. On the basis of epidemiological investigation, representative strains will be chosen for pathogenicity tests to mice and mink to screen out the virulent and attenuated strains. Differentially expressed genes correlated with the pathogenicity of Pseudomonas aeruginosa from mink will be screened out by comparative transcriptomics. The gene deletion mutants will be constructed to study the pathogenicity to animals and other related experiments so as to know the relationship between the differentially expressed genes and their virulence. This research will partially elucidate the molecular mechanism of hemorrhagic pneumonia in mink caused by Pseudomonas aeruginosa and contribute for the molecular diagnosis and drug targets screening.

铜绿假单胞菌是近50年来引起水貂出血性肺炎的主要病原菌之一，而水貂对该菌易感的机制未知。本研究在流行病学调查的基础上，选择代表菌株进行小鼠和水貂的致病性实验，筛选强毒和弱毒菌株。利用比较转录组学的方法，系统筛选引起水貂铜绿假单胞菌致病相关的主要差异表达基因，并构建差异基因的缺失突变株，进行动物致病性试验和其他相关毒力试验，研究差异基因与毒力的相关性。该研究可以部分阐明铜绿假单胞菌引起水貂出血性肺炎的分子机制，也为分子诊断和筛选药物靶点奠定基础。

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是引起水貂出血性肺炎的一种主要致病菌。目前，水貂源铜绿假单胞菌相关研究多局限于感染菌株的流行血清型调查，但有关该病原菌毒力基因的研究鲜有深入报道。本研究旨在挖掘铜绿假单胞菌强弱毒菌株差异的毒力基因，并研究其对宿主细胞的致病性。.1. 铜绿假单胞菌流行病学调查.山东省不同地区分离鉴定的60株水貂铜绿假单胞菌分别进行O-抗原血清分型、H-抗原鞭毛分型以及脉冲场凝胶电泳（PFGE）分型。结果显示：水貂PA感染与血清G型和鞭毛A型高度相关，PFGE谱型显示不同来源的菌株彼此间亲缘关系复杂多样。.2. 水貂铜绿假单胞菌强弱毒菌株的筛选.选择代表菌株，采用小鼠感染模型，根据小鼠的死亡率高低对分离株毒力进行判定，结果筛选出两株强毒菌株11092618、11092304，两株弱毒菌株11082616、QT1进行后续实验。.3. 水貂铜绿假单胞菌毒力基因的筛选鉴定.对强弱毒菌株进行比较转录组学测序，通过差异基因GO注释、KEGG注释等方法对测序结果进行基因注释及差异表达基因筛选，初步获得30个差异表达基因。通过Real-time PCR验证，最终筛选出9个可能与毒力相关的差异表达基因。.4. 水貂铜绿假单胞菌pyoS5基因毒力的相关研究.选定可编码产生绿脓菌素的pyoS5基因（pyoS5，11092618菌株，PA0985）进行基因敲除及其功能性研究。利用同源性DNA片段可发生重组的原理，筛选获得基因敲除突变株，并通过PCR扩增目的片段、DNA测序以及Real-time PCR的方法验证敲除准确。生物学特性结果显示二者到达对数生长期的时间和生长速率没有明显差异；小鼠和水貂的致病性试验显示，相同剂量下突变株的毒力较野生株降低。结果表明pyoS5基因是铜绿假单胞菌的一个重要毒力基因，该突变菌株的制备为水貂铜绿假单胞菌弱毒疫苗的研究奠定了基础。