共刺激通路阻断联合抗原特异性Treg细胞诱导异种胰岛细胞移植免疫耐受的研究

The clinical application of islet xenotransplantation has been limited by a strong T cell-mediated immune response and the requirement for unacceptably high levels of immunosuppression. B7 / CD28, CD40 / CD40L costimulatory pathway and Treg cells play an important role in the presence of immune rejection and early induction of immune tolerance after xenotransplantation respectively. However, the detail mechanism is still obscure. In our previous studies, we found that it is possible to induce immune tolerance in islet xenograft by blocking the B7 / CD28 costimulatory pathway and Treg cells may play an important role in this process. This program intends to construct porcine immature dendritic cells that can express pig-derived CTLA4Ig and mouse-derived CD40Ig specifically and inject them into diabetic mice with islet xenograft to induce immunological tolerance by blockage of B7 / CD28 and CD40 / CD40L costimulatory pathway. Based on the immunotolerance model, antigen-specific Treg cells are isolated to study their effects on lymphocyte proliferation in vitro. Besides, the role and mechanism of antigen-specific Treg cells in inducing specific immune tolerance of islet xenograft will be studied in vivo as well. This is of great significance for the application of xenotransplantation.

异种胰岛移植将会引发强烈的排斥反应，B7/CD28、CD40/CD40L共刺激通路及Treg细胞在异种移植术后排斥反应发生及免疫耐受中起到重要作用，但具体机制尚不明确。我们前期的研究发现通过阻断B7/CD28共刺激通路能够诱导异种移植物的长期存活，其中Treg细胞可能发挥了重要作用。本课题拟通过构建表达猪源性CTLA4Ig和小鼠源性CD40Ig的猪未成熟树突状细胞，并将其输入接受异种胰岛移植的糖尿病小鼠体内，通过特异性地抑制抗原递呈直接途径B7/CD28和间接途径CD40/CD40L共刺激信号，实现对异种移植物的免疫耐受。在免疫耐受模型的基础上，分离抗原特异性Treg细胞，通过体外实验研究抗原特异性Treg细胞对异种抗原的免疫抑制作用；并将Treg细胞输入异种移植动物体内，研究Treg细胞在诱导异种胰岛移植特异性免疫耐受中的作用及其机制。为异种胰岛移植的临床应用提供新的实验及理论基础。

异种胰岛移植是解决移植供体短缺、实现糖尿病患者血糖稳定的有效手段。但突出的问题是异种移植排斥反应更剧烈，机制也更复杂。B7/CD28和CD40/CD40L共刺激通路和调节性T细胞（Tregs）在异种移植术后排斥反应发生及免疫耐受中起到重要作用，但以上途径针对异种移植的具体机制尚不明确。本研究成功将载有猪源性CTLA4Ig融合蛋白基因和鼠源性CD40Ig基因的腺病毒载体转染猪源性imDC；在猪对小鼠胰岛移植模型中，基因修饰供体imDC经门静脉注入异种胰岛移植模型小鼠体内，成功诱导异种移植物在受者体内存活超过70天，相较于单纯胰岛移植组异种移植物存活约7天存在统计学差异（P<0.05）；对免疫耐受模型小鼠给予抗CD25抗体阻断Treg细胞作用，小鼠仍可继续维持免疫耐受超过30天，与未阻断组无差异（P>0.05）；从接受异种胰岛移植的各组小鼠脾脏分离的Treg细胞在体外对猪T淋巴细胞增殖的抑制效果与非特异性组小鼠脾脏分离的Treg细胞相比均无明显差异（P>0.05）；成功分离培养脂肪间充质干细胞及其外泌体，体外共培养实验初步发现随着外泌体浓度的升高，缺氧环境下的胰岛细胞活性明显增强。综上所述，本研究发现B7/CD28和CD40/CD40L共刺激通路联合阻断可以诱导异种胰岛移植免疫耐受；共刺激通路阻断诱导异种胰岛移植免疫耐受过程中，脾脏Treg细胞比例增加，但Treg发挥作用的时期可能为免疫耐受诱导期，而不主要是耐受维持期；通过异种胰岛移植模型分离的Treg细胞在体外不具备抗原特异性；脂肪间充质干细胞外泌体可能提高缺氧环境下胰岛细胞存活率。本研究为制定相应的临床胰岛移植方案及移植术后免疫耐受诱导方案的优化提供一定的实验基础。. 在项目执行期间，共发表发表了学术论文11篇，其中SCI收录7篇，培养研究生3人，其中硕士毕业1人，博士在读2人。