抗原特异性诱导人Tr1细胞的生物学特性及其在异种胰岛移植物免疫耐受中的作用研究

Xenogeneic rejection mediated by T cell response is one of major barriers to be overcome for clinical application of xenotransplantation, therefore strategies for immune tolerance induction need be developed. Type 1 regulatory T (Tr1) cells, as one subset of CD4+ Treg, can be generated from naive T cells in the presence of interleukin-10 (IL-10), which regulate suppressive capacity through IL-10. A numbers of studies suggested that Tr1 cells play an important role in maintaining and inducing immune tolerance. Our preliminary study found that xenoantigen-specific human Treg expanded in vitro showed enhanced suppressive capacity in the pig-human MLR most likely via an IL-10-mediated pathway. Here we hypothesize that a simple method for in vitro induction and expansion of IL-10-secreting xenoantigen-specific human Tr1 cells would be more efficient in transplantation immunotherapy..In this study, xenoantigen-specific Tr1 cells will be generated by human naive CD4+ T cells stimulated with two subsequent cycles of xenoantigen stimulation with recombinant human IL-10. Treg phenotype and suppressive capacity will be assessed after xenoantigen stimulation and mechanism of their suppression will be studied. Furthermore NOD-SCID IL-2rγ-/- mice will be transplanted by neonatal porcine islet cell clusters (NICC) followed by reconstitution of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) with in vitro expanded xenoantigen-specific human Tr1 cells or polyclonal expanded Tr1 cells. Human leukocyte engraftment, function and survival time of islet xenograft will be confirmed by flow cytometric and histological analyses. The mechanism and the efficiency of inducing islet xenograft transplant tolerance by xenoantigen-specific human Tr1 cells will be studied. This study will provide a theory and a feasible method for immune tolerance induction in clinical xenotransplantation.

免疫排斥成为异种移植在临床应用中的最大障碍，因此免疫耐受的诱导策略成为移植免疫学研究的热点。1型调节性T细胞（type 1 regulatory T cell，Tr1细胞）作为调节性T细胞（Treg）的一种亚群，能在体内外诱导分化并在维持和诱导免疫耐受中扮演着重要作用。我们前期研究发现体外诱导的异种抗原特异性Treg通过IL-10发挥抑制功能。因此我们推测分泌IL-10的人异种抗原特异性Tr1细胞的回输将成为移植免疫疗法的更有效手段。本项目拟通过体外诱导分化具有异种抗原特异性的人Tr1细胞，研究其生物学特性及作用机制，回输抗原特异性Tr1细胞至人源化小鼠异种胰岛移植动物模型中，观察异种胰岛移植物存活时间，研究抗原特异性Tr1细胞诱导异种胰岛移植物耐受的分子机制，评估抗原特异性Tr1细胞诱导异种移植物耐受的效率。本项目的完成将为临床异种移植免疫耐受的诱导提供理论基础和新的可行性方案。

1型调节性T细胞（type 1 regulatory T cell，Tr1细胞）能在体内外诱导分化并在维持和诱导免疫耐受中扮演着重要作用。我们前期研究发现体外诱导的异种抗原特异性Treg能够增强其抑制功能。因此我们推测分泌IL-10的人异种抗原特异性Tr1细胞的回输将成为移植免疫疗法的更有效手段。本项目中将健康人外周血中分离获得的人初始CD4+T 细胞，经猪PBMCs 与IL-10 联合IL-2 和IL-15 在体外连续培养两个周期，来获得异种抗原特异性Tr1细胞。用流式细胞术对其细胞表型进行检测，荧光定量PCR检测其功能基因的表达，酶联免疫吸附实验检测其细胞因子的分泌水平，体外混合淋巴细胞反应检测异种抗原特异性Tr1细胞在异种抗原免疫应答中的抑制功能及异种抗原特异性。建立人源化NOD-SCID IL-2rγ-/-小鼠异种胰岛移植模型，回输体外诱导的异种抗原特异性Tr1细胞，检测小鼠外周血、脾脏和移植物中人源细胞的植入情况，观察异种胰岛移植物存活时间，评价异种胰岛移植物功能，评估异种抗原特异性Tr1 细胞诱导异种移植物耐受的效率。本项目研究发现经过两个周期异种抗原刺激联合IL-10、IL-2 和IL-15能诱导出Tr1细胞，且该细胞高表达CD49b、LAG-3和CTLA-4，不表达Foxp3，表现出效应记忆Treg的表型，同时高表达CD39。经过异种抗原刺激后，Tr1细胞高表达IL-10和IL-5，并且其TCR Vβ2，TCR Vβ9和TCR Vβ13的表达增高。除此之外，经异种抗原刺激的Tr1细胞能在异种抗原刺激混合淋巴细胞反应中的增强抑制能力并呈剂量依赖效应，并且能通过CD39发挥抑制作用。另外还发现IL-5能够影响异种抗原特异性Tr1细胞的增殖，但不影响其表型的表达。体内实验结果显示，与多克隆Tr1细胞相比，回输异种抗原特异性Tr1细胞能显著减少异种胰岛移植物的损伤，延长移植物存活时间，能够更有效的预防异种移植物的排斥，诱导移植物耐受。因此，回输具有异种抗原特异性的Tr1细胞能够作为的诱导移植免疫耐受的有效手段，以实现在保存有效免疫功能的情况下，减少免疫抑制剂带来的毒副作用。该项目研究结果为Tr1细胞诱导移植物免疫耐受提供了新的方法，为Tr1细胞在临床中的应用提供了理论基础。