深海链霉菌Streptomyces drozdowiczii SCSIO 10141来源的抗菌甲哌霉素类化合物的生物合成研究

Marforpipcins A-E belonging to a group of cyclodepsipeptides, are novel compounds isolated from Streptomyces drozdowiczii SCSIO 10141 from the South China Sea deep sea sediment by our group. Marforpipcins possess novel structural elements and showed strong inhibition activity against Propionibacterium acenes and Micrococcus luteus, holding great promise in antibacterial drug discovery. The biosynthetic study of these compounds have not yet been carried out. In this application, we propose:1) to clone the gene cluster governing marforpicins using genomic scanning and bioinformatics analysis methods; 2) to make gene replacement mutants and analyze their metabolite products; 3)to overexpress the key enzymes in vitro and perform biochemical assays to elucidate some key biosynthetic events. This study will generate chemical derivatives and shed light into the genetic basis of marforpipcins.

甲哌霉素（marforpipcins）属于环酯肽类抗生素，是我们课题组从我国南海深海链霉菌Streptomyces drozdowiczii SCSIO 10141中分离得到的一类新化合物。该类化合物结构新颖，对痤疮丙酸杆菌和藤黄微球菌有较强的抑制作用，但对苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌不显示抗菌活性，提示其作用机制独特，但该类化合物的生物合成机制尚不清楚。本项目拟综合运用海洋微生物学、微生物遗传学和天然产物化学等多门学科专业技术，利用基因组扫描和生物信息学分析获取其生物合成基因簇，建立菌株的遗传操作系统，构建基因组粘粒文库并筛选出阳性克隆，利用PCR-targeting技术构建基因突变株，产生生物合成中间体或结构类似物，并对关键酶进行体外蛋白表达和生化测定，阐明其生物合成机制，为抗感染药物开发提物质基础。

甲哌霉素（marformycins）属于环酯肽类抗生素，是本课题组从我国南海深海放线菌Streptomyces drozdowiczii SCSIO 10141中分离得到的一类新化合物。该类化合物结构新颖，对痤疮丙酸杆菌和藤黄微球菌有较强的抑制作用，但对苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌不显示抗菌活性，提示其作用机制独特，但该类化合物的生物合成机制尚不清楚。本研究利用基因突变、异源表达技术和体外生物化学的方法阐明了甲哌霉素的生物合成机制，阐明了负责独特结构形成的功能基因及形成机制，研究结果如下：生物合成基因簇长45kb，由20个ORF(open reading frame)组成，其中六个NRPS蛋白(mfnCDEFKL)和相关蛋白负责构建了环脂肽核心骨架结构，其中包括1个甲酰基转移酶（mfnA），1个甲基转移酶（mfnG），1个细胞色素P450氧化酶（mfnN）；mfnM编码1个正调控因子起正调控作用, 而mfnR编码ABC转运蛋白负责甲哌霉素的胞外转运； 从mfnK突变株中发现了一个新的中间体化合物，证明了mfnK作为骨架结构基因的作用；通过体内的喂养实验和体外的酶反应结果确认了MfnG是一个L-和D-型酪氨酸-O-甲基转移酶，并对该酶的催化反应动力学进行了表征；体外对mfnA, mfnK, mfnG, 和mfnN基因突变株发酵结果的分析揭示了甲哌霉素的结构形成过程包含有(1)N-末端装配前的甲酰化，(2) NRPS装配前的酪氨酸基团的O-甲基化，(3)哌嗪酸基团的区域选择性和立体选择性的NRPS羟化后修饰等特别步骤；对MfnO和MfnH的体外表达和生化测试证明这两个酶通过一个可逆的协作催化机制转化l-Ile转化为l-allo-Ile，这最终证明了这两个酶基因负责了l-allo-Ile结构单元的形成。以上研究结果为抗感染药物甲哌霉素开发提供了理论和物质基础。