GCLC基因上游抑制元件以及其生理意义研究

细胞凋亡是氧化应激所引起细胞病变的重要机制，参与多数重大疾病的发生发展过程。我们在研究在GSH合成限速酶GCLC基因上游调控序列时，发现存在以EBOX元件为参照核心的转录抑制区域，其转录抑制作用可能涉及多个相互作用的元件和因子，使转录抑制作用具有细胞或组织特异性。研究结果和资料分析均支持我们的一个假说：EBOX区域的各种因子活性与组成变化可能通过对GSH合成抑制的调控，导致GSH耗竭,决定细胞的凋亡或存活命运。本项目研究这些元件和因子及其调节因素，以阐明其过程和生理意义；在解析相关元件/因子的基础上，利用各种模型细胞的表型分析，通过抑制或促进/激活该区域可能的结合因子，结合补充或人为耗竭GSH、抑制GCLC基因表达，实验论证上述理论，探明上游信号和各种因素对该区域因子的调节，考察这些因子在细胞凋亡中的地位。研究有利于了解相关疾病的发生发展和为药物研发提供新的靶点

本项目研究探明影响大鼠GCLC基因上游调控序列中一个抑制区域的以EBOX元件为代表的各种元件，与此元件结合的转录因子的种类和性质，以及上游信号途径，考察这些因子在细胞中的生理意义。研究发现EBOX元件在GCLC基因上游调节区域的6.0kB范围有超过50个可能的核心序列；利用突变分析和EMSA证明4个元件均具有GCLC基因转录抑制作用，另外15个也具有转录活性，尚有超过20个元件未能完成分析。研究发现这种元件结合除经典的USFs因子外，利用EMSA、突变分析和GCLC报告载体分析证明还结合DECs家族转录因子，使得研究的复杂性大大增加。由于有大量的EBOX元件聚集，理论上已无法逐个研究、只能通过非精确的其他手段开展研究，不能够全部突变以消除背景影响。因此导致计划书规定的研究目标难以实现。另外研究证明外源性条件并不通过EBOX元件结合的转录因子实现GCLC调控，无法建立有效地细胞可调控模型，是研究不能获得较大突破的原因之一。虽然整体未能按照研究计划取得预想的结果，但在过程中依然有大量的研究数据能够为今后的研究提供指导，并可能在结题后继续总结一些有益的结论。.1. EBOX元件能够与至少两种转录因子结合并具有调节作用。其中DEC的作用更为强烈。2.发现各种细胞GCLC能够在核内有高浓度的表达，核内GCLC的分子量明显小于胞质蛋白。可能的入核条件已经缩小到细胞贴壁的3-5小时时段，与beta-catenin因子活化以及转位、以及其上游与细胞间接触、细胞于基质结合相关的FAK、GSK激酶的状态有明显关系，这个现象可能与基因组的稳定性有关。3. 一般认为tBHQ、H2O2、beta-NF等刺激会稳定nrf2，是GCLC以及其它抗氧化酶表达增加的原因，keap1是控制其降解的关键，我们的研究结果与此相符。我们发现tBHQ与其余两个因子不同，能够促进大分子量Nrf2的增加，阻止其降解并入核；进一步的分析发现这个过程同时伴随有Keap1的高聚化，keap1的高聚化又与自噬相关蛋白P62的高聚化有关。因为P62的高聚通常与锌离子的状态有关，我们分析了tBHQ处理时细胞内锌离子的浓度，发现细胞内游离锌不依赖于胞外锌增加，活化P62启动自噬降解Keap1蛋白，促进GCLC表达。是对GCLC表达机制的新发现。