热激活的质膜钙通道CNGC6调控机制的研究

High temperature stress results in a severe impact on growth and development of crop plants. Thus, the study about thermotolerance mechanism of plants attracts much attention. An increased concentration of cytosolic calcium ions (Ca2+) is an early response by plant cells to heat stress. Our previous completed fund project demonstrates that a member of A. thaliana cyclic nucleotide-gated ion channel family, CNGC6, mediates heat-induced Ca2+ influx, and facilitates the acquisition of thermotolerance. However, the molecular mechanism by which CNGC6 regulates thermotolerance of plants is unclear. In this study, with molecular genetics, electrophysiology, cell biology and biochemistry methods, we shall investigate the regulation factors of opening and closing of CNGC6 Ca2+ channel, and downstream molecular pathway by which CNGC6 affects thermotolerance of plants, in order to elucidate the regulation mechanism underlying production, transduction of Ca2+ signal and the acquisition of thermotolerance, and perfect the Ca2+/CaM pathway of heat shock signal transduction proposed by us. This project has obvious significance to uncover thermotolerance mechanism of plants, and provides available genes for increasing thermotolerance of plants using biologic technologic ways.

高温胁迫对农作物生长发育造成严重危害，因此植物耐热性机制的研究备受关注。细胞质中Ca2+浓度升高是植物应对高温胁迫的早期响应。我们前一结题基金项目证明拟南芥环核苷酸门控的离子通道(CNGCs)蛋白家族成员CNGC6，介导热诱导的质外体Ca2+内流并促进植物的耐热性。然而，CNGC6钙通道调节植物耐热性的分子机制还不清楚。本课题以分子遗传学、电生理学、细胞生物学和生物化学的方法，研究影响CNGC6钙通道开放和关闭的调节因子，及CNGC6影响耐热性的下游的分子途径，旨在阐明热激时植物细胞内Ca2+信号产生、转导及耐热性获得的调控机制，完善我们前期提出的热激信号转导的钙-钙调素途径。本研究对揭示植物耐热性机制具有重要理论意义，并为利用生物技术方法提高植物耐热性提供了可利用的基因。

我们先前的研究证明了拟南芥CNGC6是一个受热激活的钙通道蛋白，并且与植物的耐热性相关。本课题进一步研究CNGC6钙通道活性的调控机制。通过GUS报告基因分析及Real-time PCR方法所获得的结果表明CNGC6基因在拟南芥中是泛在表达的。通过GFP报告基因分析的方法获得的结果表明CNGC6蛋白定位在质膜上。通过real-time PCR方法比较了热激后野生型、cngc6突变体、突变体恢复株系及CNGC6过表达株系中HSP18.2、HSP25.3及HSP70基因表达水平的差异，结果显示cngc6突变体中以上3种HSPs的表达水平都略低于野生型，而恢复株系中3种HSPs的表达水平与野生型相似，过表达株系中3种HSPs的表达水平明显高于野生型，表明CNGC6通过调节HSP基因的表达影响植物的耐热性。进一步研究表明热激后细胞内cAMP的含量迅速升高，并且这种热激诱导的cAMP的产生是依赖腺苷酸环化酶的。以外源和内源cAMP处理野生型和cngc6突变体的原生质体，用膜片钳技术检验处理前后的质膜钙电导，结果表明CNGC6钙通道可能受cAMP的激活。此外，Real-time PCR结果说明外源cAMP能够代替热激诱导下游热激蛋白基因的产生，说明cAMP在热激信号转导中发挥作用。以钙调素的拮抗剂CPZ和W7分别处理野生型和cngc6突变体的原生质体，用膜片钳技术检验处理前后的质膜钙电导，结果表明CNGC6钙通道可能受CaM的反馈抑制。进一步，我们构建了cngc6突变体的恢复株系以及CaM结合位点缺失的CNGC6的转cngc6突变体的恢复株系，并通过膜片钳技术比较了热激前后WT、cngc6突变体、cngc6/CNGC6株系和cngc6/CNGC6Δb株系的质膜钙电流的大小，结果显示热激后cngc6/CNGC6Δb株系的质膜钙电流比cngc6/CNGC6株系更大，进一步证实了CaM对CNGC6钙通道的抑制作用。酵母双杂交实验结果表明CaM2/3/5和CaM7能与CNGC6相互作用，而CaM1/4和CaM6不能与CNGC6相互作用。pull-down 实验在体外证实了这个结果，并且证明CNGC6上的CaM结合位点可能是IQ域，而不是CaMBD域。