拟南芥线粒体HSP70在协助呼吸链复合体组装和维持活性氧稳态方面功能的研究

Heat shock protein 70 (HSP70), as a sort of important molecular chaperon, plays crucial roles in many cellular processes by helping fold, assembly or transport of some function proteins. However, there is little knowledge of the function of mitochondrial HSP70 (mtHSC70) in higher plants. Our preliminary results showed that mtHSC70-1 mutants displayed severe growth defects, such as dwarf stature and markedly decreased fertility; mtHSC70-2 mutants had not obvious difference from wild type plants, indicating that mtHSC70-1 plays main role in regulating plant growth. This project will explore the contribution of these two mtHSC70s in regulating plant growth and fertility in genetics level. Further we shall investigate the effects of mtHSC70-1 knockout on mitochondrial integrity, oxidative phosphorylation level, respiratory pathways, assembly/activity of respiratory chain complexes, and ROS homeostasis. In addition, we shall screen out partner proteins and target proteins of mtHSC70-1 using a variety of experimental methods, and investigate the effects of mutation of genes encoding these proteins on mitochondrial function and plant growth, in order to reveal the mechanism by which mtHSC70-1 regulates plant growth. This project has important meaning to improving our knowledge to regulation mechanisms of mitochondrial complexes’ assembly/activity and ROS homeostasis.

热激蛋白70（HSP70）作为一类重要的分子伴侣，协助新生蛋白质的折叠、组装或转运，在细胞生命活动中发挥重要作用。目前人们对高等植物中线粒体HSP70（mtHSC70）的功能所知甚少。我们的预实验结果表明mtHSC70-1突变体植株十分矮小且育性显著降低，mtHSC70-2突变体与野生型相比没有明显的差异，表明mtHSC70-1在调节植物生长方面发挥主要作用。本申请课题将在遗传学水平上研究这两种mtHSC70对维持植株生长和育性的贡献，进而研究mtHSC70-1突变对线粒体的完整性、氧化磷酸化水平、呼吸途径、呼吸链复合体的组装/活性以及活性氧稳态的影响。此外，我们将通过多种方法筛查mtHSC70-1的共伴侣蛋白及底物蛋白，研究其基因突变对线粒体功能及植物生长的影响，旨在揭示mtHSC70-1调节植物生长的作用机制。本课题研究可增进人们对呼吸链复合体的组装/活性及活性氧稳态调节机制的认识。

70kDa的热激蛋白（HSP70）作为分子伴侣，参与多种细胞过程。然而，植物线粒体HSP70s（mtHSC70s）的功能仍不清楚。本课题主要研究拟南芥mtHSC70在植物生长发育过程中的作用及其调节机制。我们发现拟南芥mtHSC70-1敲除突变体mthsc70-1a和mthsc70-1b的植株矮小，雌配子体畸形且育性降低。相对照，mtHSC70-1杂合突变体（mthsc70-1a+/-）和mtHSC70-2纯合突变体（mthsc70-2a-/-）没有显示植株生长和育性方面的缺陷。mthsc70-1a+/- mthsc70-2a-/-双突变体显示了植物生长及育性方面的缺陷，而纯合的mtHSC70-1和mtHSC70-2双突变体是致死的。将mtHSC70-1或mtHSC70-2基因引入mthsc70-1a中都能够拯救突变体的缺陷。以上结果表明mtHSC70-1和mtHSC70-2存在功能冗余，但在调节生长发育方面mtHSC70-1发挥主要的作用。此外，我们发现mtHSC70-1功能的丧失导致线粒体异常和呼吸途径改变；mtHSC70-1突变体的苗和胚囊中活性氧（ROS）水平增加。锰超氧化物歧化酶1（MSD1）或过氧化氢酶1（CAT1）基因引入mthsc70-1a植物中降低了ROS水平并能部分挽救植株生长和育性,表明突变体中较高的活性氧水平是其生长发育缺陷的原因。此外，mtHSC70-1突变体苗和胚囊显示了细胞色素c氧化酶（COX）组装或活性的缺陷。进一步，我们通过免疫共沉淀、pull-down及萤火虫荧光素酶互补分析技术证明了mtHSC70-1与COX亚单位2（Cox2）蛋白之间的互作，为mtHSC70-1在COX组装方面的作用提供了证据。以上数据表明mtHSC70-1在COX依赖性的呼吸作用的建立及植物生长发育中发挥重要作用。此外，我们发现线粒体J蛋白AtDjA30可以与mtHSC70-1相互作用。AtDjA30突变体与mtHSC70-1突变体一样，显示出育性降低。我们还发现AtDjA30突变体的线粒体存在功能缺陷，包括ROS水平升高和COX活性降低，表明mtHSC70-1和AtDjA30可能协同调节植物生长和发育。本课题研究增进了人们对呼吸链复合体的组装/活性及活性氧稳态调节机制的认识。