小金海棠缺铁胁迫应答基因的上游调控元件及转录因子研究

小金海棠是全球筛选出的第一个抗缺铁黄叶病苹果基因型，是我国特有的、极为重要的种质资源。以已获得的其自身与铁素吸收和转运密切相关的基因MxFRO2和MxIRT1为基础，克隆其上游启动子序列并研究调控元件功能；同时挖掘与顺式作用元件相互作用的特异转录因子，并研究其作用机制；从而为完善果树抗缺铁胁迫分子机制框架充实试验证据。

本研究以抗缺铁黄叶病基因型小金海棠为试材，克隆得到了三个与铁相关的转录因子基因MxMYB1、MxbHLH01和MxIRO2；其中MxMYB1属于MYB类家族成员，MxbHLH01和MxIRO2属于螺旋-环-螺旋（bHLH）家族成员。对这三个转录因子基因基本特性的分析结果表明，这三个转录因子均定位于细胞核，MxMYB1对缺铁反应起负调控作用，MxbHLH01和MxIRO2对缺铁反应起正调控作用；MxbHLH01没有激活能力，MxIRO2的激活能力较弱。利用原核表达纯化了MxIRO2蛋白，并制备了其多克隆抗体；转基因MxMYB1表明，MxMYB1在调控缺铁应答反应中确实起着负调控作用。同时，利用巢式PCR克隆得到了小金海棠MxIRT1、MxFRO2基因的启动子，分析了启动子的序列。对这两个启动子与铁关系的研究表明，MxFRO2启动子在细胞水平上不受缺铁诱导，这可能与原生质体是单个细胞、不能形成群体效应有关，而IAA与ABA都能够在细胞水平上诱导MxFRO2启动子的上调表达；尽管MxFRO2启动子中预测到了多种与光响应有关的元件，但MxFRO2启动子不受光照诱导，说明预测的光响应元件在该启动子中并不起作用。MxIRT1启动子在转基因拟南芥中的表达没有组织特异性，在根、胚轴、子叶、叶及花、果实中均表达，转基因拟南芥植株经缺铁处理后，检测的GUS酶活性在缺铁处理(-Fe)和对照（+Fe）之间没有显著差异，说明在缺铁条件下转基因拟南芥中的调节因子并不能增强MxIRT1启动子的活性。