质膜电压门控钙通道介导的反式肉桂醛诱导鲁氏接合酵母凋亡的杀菌机制研究

Zygosaccharomyces rouxii is the main contamination yeast in food such as pastry, fruit and vegetable juice, etc. Previous research preliminary showed that natural antimicrobial agent trans- cinnamaldehyde (T-CNMA) can efficiently kill the strain of Z. rouxii by means of inducing apoptosis, and the plasma membrane voltage-gated calcium channels (VGCCs) played an important role in mediating the apoptosis , but the mechanism remains to be elucidated. In this study, firstly, we are going to study of the effects of T-CNMA on cell activity (cell vitality and survival rate) and apoptosis (chromosome structure , metacaspase activity, etc.), and the effect of inhibition of cell apoptosis on cell activity will be also analyzed, so as to confirm that T-CNMA plays a fungicidal action for strains of Z. rouxii by inducing apoptosis. Secondly, we will study the effects of T-CNMA on the activation and opening of VGCCs, and the effects of VGCCs gene knockout or overexpression on apoptosis will be also analyzed, so as to clarify the important role of VGCCs in the induction of apoptosis by T-CNMA. Thirdly, we are going to explore the role of VGCCs in the cause of the endoplasmic reticulum stress by T-CNMA, on this basis, how VGCCs affects intracellular kinase signal transduction to mediate endoplasmic reticulum stress will be focused on, and the effect of inhibition of endoplasmic reticulum stress on cell apoptosis will be analyzed to confirm that endoplasmic reticulum stress finally induces Z. rouxii apoptosis. The results will provide a basis for the thorough analysis of the fungicidal mechanism of T-CNMA.

鲁氏接合酵母是糕点、果蔬汁等食品中的主要污染菌。前期研究初步表明天然抗菌剂反式肉桂醛（T-CNMA）可通过诱导凋亡的方式高效杀灭该菌，质膜电压门控钙通道（VGCCs）在介导该菌凋亡中发挥重要作用，但作用机制尚待阐明。本项目拟研究T-CNMA对该菌活性（细胞活力、存活率）和凋亡（染色体结构、metacaspase酶活等）的影响，并分析抑制凋亡对菌株活性的影响，进一步确证T-CNMA通过诱导凋亡发挥杀菌活性；研究T-CNMA对VGCCs活化、通道开放等的影响，并分析VGCCs基因敲除或过表达对凋亡的影响，明确VGCCs在T-CNMA诱导凋亡中的重要作用；探究VGCCs在T-CNMA引发内质网应激中的作用，在此基础上重点探讨T-CNMA作用的VGCCs如何影响激酶信号引发内质网应激，并分析抑制内质网应激对凋亡的影响，明确内质网应激最终诱发凋亡。研究结果为充分解析T-CNMA的杀菌机制提供基础。

前期研究初步发现反式肉桂醛能够高效杀灭食品腐败菌鲁氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii），但杀菌机制不详。本项目首先系统研究了反式肉桂醛对该菌的抗菌活性，发现反式肉桂醛对该菌的抑菌圈直径16.23±0.06mm，抗菌指数为1.03，最小抑菌浓度为0.156mg/mL，最小杀菌浓度为0.312mg/mL，亚抑菌浓度反式肉桂醛也具有一定抗Z.rouxii活性，反式肉桂醛对苹果汁中高污染水平Z.rouxii（6.3lgCFU/mL）生长达到了完全抑制，表明反式肉桂醛能够高效抑制Z.rouxii污染。其次，从细胞膜损伤和细胞内环境紊乱角度对反式肉桂醛抗Z.rouxii的作用机制进行了初步解析，发现肉桂醛导致Z.rouxii细胞膜通透性增加、膜完整性降低、膜电位超极化、胞内ATP含量降低、胞内pH下降、细胞表面褶皱和凹陷以及胞内结构疏松空旷等，表明反式肉桂醛可通过破坏细胞膜和细胞内环境稳态抑制Z.rouxii生长。再次，从细胞凋亡角度对反式肉桂醛抑制Z.rouxii的作用机制进行了解析，发现反式肉桂醛诱导Z.rouxii胞内ROS和Ca2+水平升高可能直接影响线粒体稳态并损伤DNA，导致MMP去极化；MMP去极化可能促进线粒体Cytc释放到细胞质中，导致Metacaspase激活，从而触发细胞凋亡进程，包括细胞膜PS外翻和DNA片段化等；表明反式肉桂醛可能通过Metacaspase依赖的线粒体途径诱导Z.rouxii凋亡。再次，对质膜电压门控钙通道在反式肉桂醛诱导食Z.rouxii凋亡中的重要作用进行了研究，发现反式肉桂醛可能作用于Z.rouxii质膜电压门控钙通道，引发胞内钙离子紊乱，最终引发Z.rouxii凋亡；表明质膜电压门控钙通道可能介导反式肉桂醛引发Z.rouxii凋亡。再次，探究质膜电压门控钙通道介导反式肉桂醛致Z.rouxii凋亡的作用途径，发现反式肉桂醛可能作用于Z.rouxii质膜电压门控钙通道，导致内质网应激，最终引发Z.rouxii凋亡。最后，转录组分析提示胞内激酶通路（酵母MAPK信号通路、激酶活性、蛋白质磷酸化等）可能参与反式肉桂醛诱导Z.rouxii凋亡。研究结果为充分解析反式肉桂醛杀菌机制提供基础，也为新型、天然、高效食品防腐剂的开发利用提供新思路。