膜型乳铁蛋白在B细胞免疫功能中的作用及其机制研究

Lactoferrin (LTF) is a multifunctional protein with anti-bacterial and immune regulatory abilities. It holds potential for the prevention, diagnosis and treatment of infectious/inflammatory disorders and tumor development. LTF is present not only in tissues & body fluids as a secreted/soluble (sLTF) protein, but also on cell surface as a membrane-bound protein (mb-LTF). However, so far the immune function of mb-LTF remains unknown. Recently we found that mb-LTF is highly expressed on the surface of murine and human B lymphocytes. Mb-LTF on B cell surface can recognize and bind to pattern-associated molecular patterns (PAMPs) like LPS & ZPS (Zhuling polysaccharide), and moreover, its crosslinking by plate-bound anti-LTF Abs triggers the proliferation, antibody and cytokine secretion of murine splenic B cells. Therefore, we reasoned that mb-LTF functions as a cell surface receptor capable of initiating intracellular signal transduction, and thereby regulates immune responses. In this proposal we will systemically investigate the role of mb-LTF on B-cell mediated immune responses triggered by T-cell dependent & independent antigens in both murine and human systems. We will define the adaptor protein(s) responsible for the anchor of LTF on cell surface, map the interacting domain, and identify the intracellular molecular events triggered by mb-LTF. This study will provide a novel mechanism for LTF's immune regulatory functions, and likely offer a new rational & direction for its applications in the prevention and treatment of immune-mediated disorders such as infectious diseases.

乳铁蛋白（LTF）是一个具有抗菌和免疫调节能力的多功能分子，在感染性疾病和肿瘤的预防、诊断和治疗方面有一定的应用前景。LTF既能以分泌蛋白（sLTF）的形式广泛存在于体液内，也能以膜蛋白（mb-LTF）的形式表达在细胞表面，但至今对mb-LTF功能的研究尚未见报道。我们近期的研究发现，人和小鼠的B细胞高表达mb-LTF, mb-LTF能够识别并结合LPS和ZPS（一种beta-葡聚糖）等病原体相关的分子模式（PAMPs），且其交联可有效的活化小鼠B细胞。因此，我们推测mb-LTF可作为细胞表面的一个参与信号通路转导的膜受体而发挥免疫功能。本课题拟系统性的研究mb-LTF在人和小鼠B细胞对T细胞依赖和非依赖性抗原免疫应答中的作用及分子机制，包括其在膜上的接头蛋白及所介导的分子信号转导通路等。本研究将阐明LTF免疫调节功能的全新机制，并为其在预防和治疗疾病上的应用开辟新的思路。

我们前期利用商品化LTF多克隆抗体的研究显示B细胞高表达膜型乳铁蛋白(mb-LTF)，且用该多抗将其交联可有效的活化小鼠B细胞，提示mb-LTF可作为膜受体而发挥免疫调节功能。在国家自然科学基金委的支持下，课题组对 mb-LTF/LTF的免疫学功能和机制以及B 细胞的功能调控这两方面进行了深入细致的研究。作为本课题的基础性工作，我们首先就B细胞增殖和分化的分子机制进行了探讨，发现下调ZBTB24可通过上调IRF-4和Blimp-1而抑制了人B淋巴细胞株Raji的细胞周期，提示其可作为B细胞功能调控中的一个全新转录因子而在体内的抗体免疫反应中发挥重要作用。随后我们成功制备了一株人LTF (huLTF)特异性的单克隆抗体 (M-860)。该抗体为小鼠IgG1(kappa)型，可用于FACS检测细胞表面mb-LTF的表达及功能研究。我们发现可溶性M-860可通过细胞表面的mb-LTF而活化人的中性粒细胞 (huPMNs)，且这一作用是部分依赖于细胞表面的TLR-4和CD14的表达，表明mb-LTF确实可作为细胞膜受体并借助于TLR-4/CD14等跨膜分子而调控免疫细胞的功能。后续实验发现分离纯化的小鼠B细胞似乎并不表达LTF的 mRNA和蛋白，而且LTF抗体对小鼠B细胞的刺激作用可能是由抗体蛋白变性后所形成的聚集物所导致的，这一结果与利用商品化LTF的多克隆抗体所得到的结果相左。为了进一步丰富课题的研究内容，我们还探讨了LTF免疫复合物的免疫调节功能和重组表达huLTF c-lobe的直接杀伤肿瘤细胞的作用，在今后的工作中将对这两方面的分子机制作进一步的研究。总之，本研究不仅阐述了LTF免疫调节功能的全新机制，拓展了我们对B细胞的生物学功能的认识，还为感染和自身免疫性疾病的预防及治疗方面开辟了新的思路。本课题执行期间发表SCI论文5篇，均标注本项自然科学基金的资助。