线粒体呼吸链复合体I的31个非核心亚基在酶复合体模块式组装中的调控作用

Mitochondrial respiratory complex I (also called NADH:Ubiquinone oxidoreductase) is a complicated membrane enzyme composed of 45 different proteins and plays critical roles in cellular ATP production and in the progress of cell ageing and cell death. Among them, 7 membrane subunits and 7 matrix proteins, encoded respectively by the mitochondrial and nuclear genomes, are the essential components of the L-shaped minimal core enzyme, which catalyzes the oxidation of NADH, electron transfer and proton transport. The remaining 31 subunits, namely the supernumerary subunits whose functions are still largely unknown, are assembled around the core enzyme. The presumed functions of the accessory subunits in the assembly and maintenance of complex I structure are the major focus for investigation in this proposed research. Expression of each subunit will be manipulated systematically by RNA-interference techniques to disturb the full assembly of enzyme. The derivative sub-complex I will be purified using various affinity chromatography, which we are going to develop, and their protein components be identified by mass spectrometry-based proteomic analysis. By such means,we will be able to further understand the effects of the inter-subunit associations on the assembly of complex I, to examine the modular assembly hypothesis, and to reveal the molecular arrangement of so many subunits. All these efforts will contribute to our knowledge of cellular energy metabolism and the aetiology of human inherited mitochondrial diseases.

线粒体呼吸链复合体I(Complex I或NADH:辅酶Q氧化还原酶)，由45种不同蛋白质亚基组装而成，是调控细胞ATP生产和细胞衰老死亡的关键酶复合体。其中，7个膜内和7个膜外的核心亚基，分别由线粒体和细胞核的基因组编码，组成Ｌ型的核心酶结构，催化NADH的氧化，传递电子和跨膜输送氢离子。而未知功能的31个非核心亚基，附合在核心亚基周边，可能调控酶的组装和活性。本项目将系统地研究非核心亚基在调控酶复合体I组装过程和维持复合体结构的作用。在培养人体细胞体系中，我们将应用RNA干扰技术系统地抑制非核心亚基的表达，阻碍复合体Ｉ的完整组装，并建立亲和色谱法分离纯化中间产物亚复合体和应用质谱-蛋白质组学方法鉴定表征蛋白质组分。本项研究将帮助我们了解非核心亚基的缺失如何影响复合体I亚基间相互作用和组装，验证模块式组装的假说，揭示复合体I的分子结构，细胞能量代谢调控机制和线粒体遗传性疾病的发病机理。

真核细胞复合体I是细胞核基因组和线粒体两个基因组共同编码的45个不同亚基组成，是线粒体呼吸链是最大最复杂的膜蛋白质复合体，是催化NADH氧化，电子传递和氢离子跨膜输送的复杂分子结构。复合体I的结构解析，机理阐明和组装过程的研究一直是线粒体生物学研究的重要前沿。本基金项目探讨研究复合体I亚基和组装因子在复合体组装过程中的作用。我们尝试在复合体I的特定亚基的肽链C端连接GST或FLAG亲和基团，在人肾胚胎细胞HEK Flp－in T-Rex表达系统中表达嵌合亚基，试图（1）建立亲和色谱分离方法便利快捷地从细胞裂解液中纯化复合体或亚复合体I，和（2）跟踪复合体I的组装中间产物，推测复合体I模块式组装的过程。虽然我们设计的GST标记亚基无法整合到复杂的复合体I结构中，我们成功利用FLAG基团标记复合体I，并利用特异性抗体琼脂胶粒实现分离快速纯化微量的复合体I。此外，我们应用合成小分子RNA干扰技术，暂时性地抑制复合体I膜外或膜内的特定亚基在培养细胞体内的蛋白质表达，从而阻断复合体I的组装而造成中间复合体I在细胞体内的积累。我们应用非变性凝胶电泳技术和转膜印迹免疫分析方法，观测到若干稳定的中间复合体。我们实验结果支持复合体I模块式组装的假说，和证实稳定的复合体I的组装中间产物的存在。我们的研究将为今后系统地研究14个核心亚基和31个非核心亚基在调控复合体I的组装过程和维持复合体结构的作用奠定基础,帮助我们了解非核心亚基的缺失如何影响亚基间相互作用，证实通过基因改造模式细胞来规模纯化亚复合体I的可行性，将帮助揭示复合体I的分子结构，细胞能量代谢调控机制和线粒体遗传性疾病的发病机理。