基于重测序的白菜雄性不育基因A8Ms_1的精细定位与克隆

Male sterility lines are ideal systems for Chinese cabbage hybrid production. Unclear inheritance pattern and long lasting transferring influence the application of genic male sterility (GMS) lines. Fine mapping and cloning of GMS gene is very important for the genetic mechanisms of GMS gene and its transferring. The GMS gene on chromosome A7 was well researched, and it was mapped on the centromeric region of chromosome A7, where is different for cloning research. A new multi-allele genic male sterility lines was found by this project team, and the GMS gene A8Ms_1 was mapped on the euchromatic region of chromosome A8. This research will focus on this gene. Depend on the genome and expression information of Brassica rapa and Arabidopsis, the new method of gene fine mapping base on re-sequencing and heterozygote detection technique, the A8Ms_1 gene will be fine mapped and cloned. This research not only provides a new gene rapid fine mapping method, but also provides useful information for elucidating the genetic mechanism of GMS and extending the application of this male sterility lines.

应用细胞核雄性不育系制种是白菜杂种配置的重要方法之一。遗传模式不清、转育时间过长是制约白菜细胞核雄性不育系应用的主要原因。细胞核雄性不育基因的精细定位与克隆对加快不育系转育速度、了解不育遗传机制有重要意义。目前白菜细胞核雄性不育基因标记及定位的研究主要针对A7染色体上的不育基因，但该基因被定位在染色体中心粒区域，难以继续进行克隆研究。本项目组通过遗传学及分子生物学研究，发现了含有新位点的白菜复等位细胞核雄性不育系统，并将不育基因初步定位在了白菜A8常染色体上。本研究拟以此A8Ms_1不育基因为研究对象，以白菜和拟南芥基因组、表达谱信息为依据，建立以重测序-杂合子检测技术为基础精细定位不育基因的方法，实现该不育基因的快速精细定位与克隆。本研究不仅提供了一种新的基因快速精细定位方法，还对阐明雄性不育形成机制、扩宽该类型雄性不育系的应用具有重要意义。

大白菜（B. rapa L. ssp. pekinensis）是起源于中国的十字花科芸薹属作物，存在显著的杂种优势，应用细胞核雄性不育系制种是白菜杂种配置的重要方法之一。遗传模式不清、转育时间过长是制约白菜细胞核雄性不育系应用的主要原因。目前白菜细胞核雄性不育基因标记及定位的研究主要针对A7染色体上的不育基因，但该基因被定位在染色体中心粒区域，难以继续进行克隆研究。本研究以位于新位点的复等位雄性不育基因A8Ms_1为研究对象，对不育基因初定位，然后以白菜和拟南芥基因组、表达谱信息为依据，建立以重测序-杂合子检测技术为基础精细定位不育基因的方法，并对该不育基因精细定位，筛选候选基因。通过项目实施，构建初定位分离群体用于不育基因的初定位，重测序群体用于杂合子分析及精细定位。重测序群体为939A与L143杂交，F1代不育，但后期有微量花粉，利用微量花粉构建F2代。F2代884个单株中可育株198株，不育株686株（χ2=3.1916<χ20.05=3.84），符合单基因显性遗传规律。在初定位群体不育池及可育池间共筛选了88对InDel引物，发现3个InDel标记。在重测序群体的不育池及可育池间共筛选位于A08染色体上的265对InDel引物和28对SSR引物，发现8个标记与不育基因紧密连锁。通过标记序列比对，该区间与初定位群体定位区间一致。在重测序群体中分别将190株可育株和320株不育株分别混合构建超级可育池和不育池用于重测序，重测序深度不小于50×。全基因组杂合度分析定位基因法利用SNP-index值作为标准，衡量两亲本基因对两池内基因频率的贡献，最终将不育基因Ms定位于A08染色体末端19,250,000-21,670,000的范围内。利用重测序数据，在初定位外侧标记的804kb范围内设计22对SSR及42对InDel引物。通过标记筛选，结果发现5个InDel标记与不育基因紧密连锁，加密后最近两侧标记为Br19499732与Br19553530，距离Ms的遗传距离分别为0.7cM和1.3cM，两标记间物理距离53.8kb。该区域包含11个基因。根据基因组注释信息、TAIR和KEGG2数据库信息分析以及荧光定量分析，预测不育基因候选基因在Bra016849、Bra016852和Bra030803中，待下一步转基因验证分析。