基于多酶靶标偶联亲和超滤LC-MS技术的余甘子中降糖活性成分的快速发现

α-glucosidase and PTP1B are the important target for screening the active constituents to regulate postprandial hyperglycemia. Affinity ultrafiltration coupled with LC-MS is a new method of rapid drug screening, mainly for the discovery of bioactive small molecules. A variety of edible plant resources were used to screen hyperglycemia activity in vitro, Phyllanthus emblica L extract has been shown to exhibit significant enzymes inhibitory activity and regulate the relevant gene expression in LO2 model. Our project is intended to isolate and identify the hyperglycemia active ingredients from Phyllanthus emblica L based on the affinity ultrafiltration coupled LC-MS technique, in order to elucidate the active structure and hyperglycemia mechanism of Phyllanthus emblica L. A variety of column chromatography techniques were used for the separation and purification of hyperglycemia active constituents. Spectroscopic methods were used to identify their structure. Hyperglycemia activity of the isolated pure compounds was tested through high-throughput screening method, and the mechanism was further investigated. The hyperglycemia screening platform based on “affinity ultrafiltration coupled with LC-MS online testing, fast and efficient activity screening, targeted, mechanism” was set up for this project. We will establish a method of screening new rapid relevant enzymes-based hypoglycemic functional foods and provide a scientific and experimental basis for Phyllanthus emblica L to process to hypoglycemic foods.

α-葡萄糖苷酶和PTP1B酶是筛选降血糖活性物质的重要靶点。亲和超滤偶联LC-MS是一种快速的新的药物筛选方法，主要用于生物活性分子的快速发现。我们前期研究了多种可食性植物降血糖相关靶酶活性，发现余甘子具有显著的酶抑制活性，并能调节肝细胞LO2中相关基因的表达。本项目拟在前期研究的基础上，采用糖尿病靶酶结合亲和超滤偶联LC-MS技术对余甘子中的降糖活性成分进行靶向分离，阐明其活性的物质基础及降糖作用机理。采用多种柱色谱对余甘子降糖活性成分进行分离纯化，应用波谱学方法鉴定其结构，采用高通量酶抑制筛选方法对分离鉴定的化合物进行活性测试，并研究其酶抑制作用机理。构建集“亲和超滤偶联LC-MS在线检测、快速高效活性筛选、靶向、作用机理”于一体的降糖活性成分筛选平台。本项目的研究，有利于建立一个快速的基于酶靶标的降血糖功能食品筛选新方法，可为余甘子的深加工，开发成降糖功能食品提供实验基础及科学依据。

余甘子具有显著的α-葡萄糖苷酶抑制活性，并能调节肝细胞LO2中相关基因的表达。本项目研究余甘子对LO2细胞葡萄糖转运蛋白2 (GLUT-2) 和过氧化物酶体增殖物激活受体-γ (PPARγ) mRNA表达及过氧化物酶体增殖物反应元件 (PPER) 和核转录因子kappa B (NF-κB) 活性的影响阐明其降血糖作用机制；采用Real-Time PCR和荧光素酶报告基因方法研究其有效组分对GLUT-2和PPARγ mRNA表达和PPER和NF-κB荧光素酶活性。进一步采用Sephadex LH-20，ODS和制备HPLC等柱色谱技术对其降糖活性部位进行分离纯化，根据NMR和HR-ESI-MS数据鉴定结构；采用体外方法测定化合物抑制α-葡萄糖苷酶活性。采用体外微量96孔板α-葡萄糖苷酶-PNPG反应模型测定柯里拉京对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，并进行抑制动力学试验，以非线性拟合法分析了其对α-葡萄糖苷酶的抑制动力学参数，同时采用分子对接模型研究了柯里拉京与α-葡萄糖苷酶相互作用的机制。余甘子提取物可以显著升高GLUT-2和PPARγ mRNA的表达和PPRE报告基因的活性，抑制脂多糖诱导的炎症反应，可以降低NF-κB报告基因的活性，随着浓度的升高其抑制作用增强。大孔树脂柱30%乙醇洗脱物为其有效活性组分。从活性部位中分离并鉴定了7个酚类化合物，分别为：没食子酸(1)，没食子酸甲酯(2)，1-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖苷(3)，1,6-二-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖苷(4)，柯里拉京(5)，粘酸-1,4-内酯-2-O-没食子酸酯(6)，粘酸-2-O-没食子酸酯(7)。没食子酸衍生物是余甘子抑制α-葡萄糖苷酶活性成分。另外，从90%乙醇洗脱部位也分离鉴定了四个化合物，分别为鞣花酸(7)，鞣花酸3-O-葡萄糖苷(8)，鞣花酸3-O-木糖苷(9)和鞣花酸3-O-鼠李糖苷(10)。主要酚类活性成分柯里拉京对α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度IC50为15.33 µM，显著低于阳性对照阿卡波糖的IC50（79.88 µM）；非线性拟合结果发现柯里拉京对α-葡萄糖苷酶的抑制作用为混合型抑制；氢键是柯里拉京与α-葡萄糖苷酶之间相互结合的主要作用力。