基于微流控芯片技术的单个肿瘤细胞迁移、浸润分析及对应单细胞转录组分析研究

Due to the thriving development of next generation single cell sequencing, biology has been shift its way from deciphering data by conventional bulk experiments to singe cell analysis. Tumor metastasis and invasion have been the major cause of death in most cancer case patient. More and more evidences have shown that the tumor invasion and metastasis raised from heterogeneous growing tumor body where single cell may play a important role in this complex such as epithelial-to-mesenchymal transition. Therefore, we plan to using microfluidic device to quantitatively study the dynamic phenotype of single tumor cell metastasis and invasion with a high-content way. To address the defects in conventional oncology and tumor biology, after precisely retrieval of targeted cells from chip, those cells can be analyzed by single cell RNA-sequencing which allows us to quantitatively dissect corresponding single cell data with bridged the phenotype and transcriptome. In addition, we plan to reconstruct the cell niches such as extracellular matrix and cell-cell communications within microfluidic device where migration and invasion could be profiled by time-lapse single cell imaging analysis. Consequently, we will integrate those big-data in single cells and try to unveil the correlations between some unique transcripts such as Long-noncoding RNAs and metastasis. Finally, we will also try to implement our new method in some clinical samples like the circulating tumor cells to evaluate the tumor progression and heterogeneity of the real patients.

当前生物学的发展已经从对大量细胞数据结果的系综平均判读进入了全新的单细胞时代。肿瘤转移与浸润是肿瘤病人致死最直接的原因，很多证据表明转移的发生过程中单细胞事件不断演化起到了重要的作用。因此，我们计划利用微流控芯片这一当今分析化学中的重要技术手段，在单细胞水平上实现大规模肿瘤细胞迁移浸润的表型生物学定量分析，并结合芯片技术，有针对性地对目标细胞进行回收和转录组测序分析研究。该新方法将有可能建立单细胞“定量表型大数据－全转录组表达谱”之间的对应定量关系。并且，我们将利用芯片中的尺寸效应建立和模拟独特的细胞微环境，探讨单个肿瘤细胞在迁移、浸润等过程中与外周环境如细胞外基质等的相互作用，通过大规模成像数据对细胞的迁移、浸润表型进行定量分析。我们将进一步结合测序数据，尝试揭示非编码转录本如非编码长RNA等与细胞迁移浸润之间的关系，探索单细胞异质性，并利用该技术方法尝试定定量分析临床病理样品。

本项目针对单细胞水平上的肿瘤细胞迁移侵润模型结合微流控芯片技术，致力于发展和建立“定量表型大数据-全转录组分析”之间的对应定量关系。通过利用3D打印微流控装置，我们在体外重构了肿瘤细胞与周边成纤维细胞的相互作用，从而能够以最小化的微流控技术重现肿瘤微环境。该方法可以与传统的移液器操作相兼容。通过显微成像的方法可以对肿瘤细胞，成纤维细胞的迁移、侵润以及相互作用表型进行定量分析。在极少量单细胞的整个转录环境 (RNA-seq)上，成纤维细胞显示出从正常到癌相关成纤维细胞 (CAFs)样阶段的转变，并且肿瘤细胞表现出过度活跃的核糖体生物发生。鉴于其易于使用、3D打印器件的可开源性、与分子分析的完全兼容性的特点，该方法提供了一种体外实验系统，以提高对肿瘤发生和相应的肿瘤微环境的认识 (Adv. Healthcare Mater., 2020, 1901713)。我们通过芯片通道中的特殊设计，制作了用于单细胞捕获的带有细微拦截结构的微流控芯片单个细胞被拦截之后在指定区域贴壁生长，在细胞外基质浓度梯度的刺激下，单个细胞向不同的方向进行迁移并对迁移数据进行定量化的采集和分析。在后续分析中，应用单细胞RNA测序分析技术对转录组进行分析并与表型数据进行比对，从而对肿瘤细胞在外基质作用下的定向迁移给出分子生物学机制上的阐释。另外，我们通过利用两个含有不同尺寸微坑设计的微流控芯片，将不同种的细胞分别在微坑中培养成为细胞团块 (直径150 µm左右)，然后通过简单的移液操作使得不同的细胞团之间形成1:1的高效配对，对肿瘤在三维环境中的侵润和转移做了高内涵式的表型解析。结果表明：该方法可以在肿瘤细胞团进行3D迁移过程中精确地分析和区分不同肿瘤团块之间的转移速度区别，并进行了后续的基因表达分析和转录本分析 (Anal. Chem. 2020, 92, 11, 7638–7645)。此外，我们发展出了系列的研究肿瘤细胞三维团块培养和分析的方法学，工作形成了一定的系统，取得了一定的国际关注 (Anal. Chem., 2018, 90, 777–784.; Anal. Chem., 2019, 91, 4307-4311.；Sci. Rep., 2019, 9, 19717)。