微流控芯片单细胞microRNA表达分析研究

目前围绕microRNA展开的一系列研究工作已成为包括生命科学、生物医学、药物学等诸多领域关注的焦点。本项目针对目前microRNA研究方法中尚存的一些问题，结合微流控芯片和微液滴技术的优势，开发针对microRNA特点的高灵敏度、高通量的单细胞分析技术平台。该技术通过简单的芯片设计即可实现微液滴包裹单细胞、细胞破膜、反转录和实时定量PCR反应等步骤，没有液滴融合，加试剂等操作，大大降低样品和试剂的消耗，减少样品间交叉污染的可能并达到高通量分析。细胞在纳升级液滴中释放内容物，可以有效防止microRNA被载流稀释，大大提高灵敏度。该技术可以从单细胞角度研究microRNA在不同时期的细胞以及相同状态细胞中不同microRNA的表达规律，能够为研究microRNA调控机制和作用机理等工作提供新的工具和平台，对相关领域的发展有望发挥重要的作用和意义。

通过本项目的研究，我们开发了纳升级液滴阵列芯片定量PCR系统和单细胞分析平台。该系统包括液滴阵列芯片、温控和荧光检测系统以及自动点样平台几个部分。液滴体积可以从1nL到500nL，在1cm×1cm范围内可实现36-256个平行PCR反应。对于常规定量PCR分析，仅用移液器便可以完成36个500nL液滴阵列的平行反应。对于单细胞分析，采用自行设计的三维点样系统完成256个50nL液滴阵列，实现单细胞包裹，破膜，加试剂，反转录和定量PCR反应等多步操作，其中，单细胞包裹效率约为30%。采用该系统，我们成功地实现了组织和细胞中的microRNA表达量的分析。其中，以mir-122为例，该系统的检测灵敏度为103拷贝，线性范围为103-109拷贝，总RNA的检测限达到1pg。我们采用该系统实现了单个肝癌细胞Huh-7中mir-122的表达分析，实验结果表明，单个Huh-7细胞中mir-122的含量在3000-24000之间变化，个体间存在很大的差异性，而大量细胞实验的平均结果在12000左右。实验证明该系统不仅可以用于TaqMan探针定量PCR系统，也可以用于SYBR Green定量PCR分析，具有普遍适用性和实际应用价值。