基于微流控芯片的单细胞分泌因子分析研究

Cytokines play an important role in many physiological and pathological processes. The analysis of cytokines at single cell level is benefit for determining cell phenotype, and provides fundamental data for immune response and cancer heterogeneity. As the secretion of cytokines is a slow and dynamical process, the diffusion of secreted cytokines cause the ultra-low concentration in local region. Therefore, the former analytical methods of single cell cytokines have some problems, such as low capture effiency of single cell, low throughput, sever cross contamination, et al, which is emerging as a barrier to accurate monitoring of cellular immunity and effective pharmacological therapies. Our program will construct a new microfluidic device for single cell cytokines analysis. By using droplet as single cell container and microstructures as the vessels of immune analysis, we analysis the secreted IL2 of Jurkat cell by the magnetic bead based sandwich immunoassay. This microfluidic based single cell analytical method has high throughput and high sensitivity, and will be a new tool for immune response and cell heterogeneity research.

细胞因子参与人体多种生理和病理过程的发生和发展，在单细胞水平开展分泌因子分析可确定细胞表型和功能差异，为免疫应答及调节机制、肿瘤异质化等研究提供数据支撑。由于细胞因子分泌是一个缓慢且动态变化的过程，随机扩散导致局部浓度极低，现有单细胞分泌因子分析技术存在单细胞捕获困难、定量准确性差、分析通量低、交叉污染等问题，难以真实准确的获取大量单细胞分泌因子信息，阻碍了细胞免疫性和药物治疗的准确监测。本研究拟将芯片液滴与微结构阵列组合使用，以液滴为单细胞捕获及细胞因子分泌富集的封闭微小空间，以微结构为液滴破乳后免疫分析的独立空间，构建高通量的单细胞微流控分析系统。在此系统上，以Jurkat细胞为模型体系，白细胞介素（IL2）为分析对象，磁珠夹心免疫为分析方式，建立一种高通量、高灵敏度的单细胞分泌因子分析新方法，为免疫监测和细胞异质化研究提供新的技术手段。

细胞因子参与人体多种生理和病理过程的发生和发展，在单细胞水平开展分泌因子分析可确定细胞表型和功能差异，为免疫应答及调节机制、肿瘤异质化等研究提供数据支撑。本项目针对单细胞分泌因子分析存在的定量准确性差、分析通量低等问题，从微流控液滴高通量制备技术和蛋白质免疫检测技术两个方面展开研究，取得了一些重要的研究进展和结果。针对多相液滴需要复杂流体控制，无法采用“肩并肩”乳化方式进行大规模制备的难题，我们以溶剂挥发诱导的液液相分离为基础，发展了一种多相液滴形成方法，只需一步乳化就可实现多种复杂高级结构液滴的制备，可以灵活调节多相液滴各部分的组成、液滴的形貌以及液滴各部分的内含物，且与现有的液滴规模放大技术兼容，有利于复杂液滴在高通量筛选及分析方面的应用。氟碳油的气体渗透性导致捕获液滴的体积逐渐缩小，影响细胞活性。为此，我们发展了一种被动的水两相液滴形成方法，成功实现了水两相液滴的捕获，磁珠在水两相液滴的包裹，以及液滴内单细胞的培养。水两相液滴既具有液滴的相对封闭环境，又能与连续相进行物质交换，有利于保持细胞活性，适用于细胞的长期培养和观察。蛋白质的超灵敏检测技术是实现单细胞分泌因子检测的关键。为此，我们发展了一种基于磁珠夹心免疫的蛋白质超灵敏检测技术，检测限可达3aM，线性范围具有两个数量级，可用于各种细胞因子和蛋白标志物的超高灵敏检测。该方法具有一定的普适性，灵敏度高，选择性好，可以实现临床样本中各种细胞因子和蛋白标志物的超高灵敏检测，满足单细胞分析的灵敏度需求。整体而言，项目在微流控液滴、单细胞、蛋白免疫分析等方面均有所进展，执行期间，共发表了5篇SCI论文，申请国内发明专利2项，培养硕士研究生4名，获得了预期的研究成果。