葡萄白腐病效应子AvrGWrR1激发抗病基因GWrR1启动刺葡萄免疫机制的研究

Grapevine white rot fungus， as one of the most serious pathogens, can cause damage to grapevine and reduce the overall production. Hence, it is important to identify the resistant genes and regarding mechanism. The first，we get a series of mutant strains of Coniella diplodiwlla by GFP marked, the second we detect the interaction between GWrR1 genes and AvrGWrR1from pathogen. through tobacco transient expression system and grapevine mesophyll protoplast system. Then through the subcellular localization and double molecular fluorescent light nuclei positioning technology demonstration, detection and GWrR1 protein interactions in the grape disease resistance reaction. The third using yeast double hybrid and Co-IP technology to anchor the target of effectors. Eventually, verificate the disease resistance mechanism of resistance genes based on all acquired information.

葡萄白腐病是危害葡萄果实病害之一，在获得葡萄抗性种质刺葡萄和抗性基因GWrR1基础上，通过病原菌生理小种SDYT的三代测序和转录组分析，获得了候选效应子。本项目首先通过分析葡萄白腐病原菌的测序结果，构建葡萄系列白腐菌效应子缺失的系列GFP突变株，动态观测病原菌侵染过程、筛选有效白腐病效应子、检测效应子致病规律；然后利用烟草瞬时表达体系和葡萄遗传原生质体诱导体系，研究葡萄白腐病抗性基因的和结构域分别在抗性信号传导和病原菌特异识别方面的作用；再通过亚细胞定位和双分子荧光技术验证的细胞核定位，检测与GWrR1葡萄抗病反应重要蛋白质的互作；最后，利用酵母双杂技术和免疫共沉淀，对效应蛋白在葡萄体内的作用靶标进行筛选。为真菌病原体的分子监控和早期检测提供宝贵的工具，未来有望通过抗性基因的采用来阻止疫情发生。

白腐病是危害葡萄生产的重要真菌病害，然而葡萄抗白腐病的分子机理仍不清楚。抗病蛋白与病原菌效应蛋白互作是调控植物抗病性的重要因子。因此，本文以鉴定白腐菌效应蛋白为切入点，通过筛选其靶蛋白来鉴定抗病刺葡萄中的抗病基因。主要内容和结论如下：.利用三代测序技术开展白腐菌Coniella diplodiella全基因组测序，基因组大小为40.93 Mb，测序深度达145X，组装到13个contigs，N50达到3.99 Mb，包含9403个蛋白编码基因，其中97.14%能被功能注释。通过生物信息学预测到608个基因编码胞外分泌蛋白，其中248个为功能未知蛋白，基于效应蛋白往往具有种属专一性，缺少保守的功能结构域或基序，将这248个分泌蛋白作为候选效应蛋白（CEPs）。.通过本氏烟草叶片中农杆菌介导的基因瞬时表达分析，从43个CEPs中筛选到效应蛋白CdE1（Coniella diplodiella effector 1）能够抑制Bax蛋白诱导的程序性细胞死亡。证实CdE1为分泌蛋白且具有细胞死亡抑制功能，侵染过程中基因表达增加，定位于植物的细胞核和细胞质中，能够抑制葡萄的抗病反应。.通过刺葡萄酵母双杂交文库筛选到CdE1的互作蛋白富含半胱氨酸类受体激酶VdCRK10（VIT_10s0116g00150），酵母双杂交、萤火素酶互补和双分子荧光互补验证其互作。瞬时过表达VdCRK10增强葡萄对白腐病抗性，其启动子结构变异可能参与调节其转录表达。