内质网应激在氟斑牙形成中的作用和机制

目前在氟斑牙发病机制研究中普遍认为，过量氟是通过降低成釉细胞基质蛋白酶的分泌或抑制其活性，干扰对基质蛋白的降解，最终导致了釉质矿化异常。然而，氟是通过什么途径影响了基质蛋白酶的表达，即氟在成釉细胞内最初的作用机制还未彻底阐明。研究发现，内质网是细胞内蛋白质合成和分泌的主要场所，而任何能造成内质网腔内Ca2+稳态改变的因素，都会使细胞产生内质网应激(ERS)，以维持内环境的稳定。本课题以动物模型和体外培养成釉细胞为研究对象，采用免疫组化、透射电镜、共聚焦显微镜、流式细胞术、Western blotting、RT- PCR 等技术，通过观察不同浓度的氟对成釉细胞超微结构及内质网伴侣基因和蛋白表达的影响，探讨氟可能引起的成釉细胞ERS的途径和机制，并进一步探索ERS及其介导的细胞凋亡在氟斑牙形成中的作用，期望本课题能在氟斑牙发病最初机制研究上有新的突破。

目前在氟斑牙发病机制研究中普遍认为，过量氟是通过降低成釉细胞基质蛋白酶的分泌或抑制其活性，干扰对基质蛋白的降解，最终导致了釉质矿化异常。然而，氟影响基质蛋白酶的表达的机制还未彻底阐明。研究发现，内质网是细胞内蛋白质合成和分泌的主要场所，而任何能造成内质网腔内Ca2+稳态改变的因素，都会使细胞产生内质网应激(ERS)，以维持内环境的稳定。本项目以动物模型和体外培养成釉细胞为研究对象，采用免疫组化、透射电镜、共聚焦显微镜、流式细胞术、Western blotting、Real-time PCR 等技术，通过观察不同浓度的氟对成釉细胞超微结构及内质网伴侣基因和蛋白表达的影响，探讨氟可能引起的成釉细胞ERS的途径和机制。研究结果，随着氟浓度升高，成釉细胞内的Ca2+荧光强度逐渐增强，细胞活性从促进增殖发展到逐渐抑制，内质网应激伴侣分子GRP78、CASPASE-12的表达增加，继而细胞凋亡百分率增高，XBP1、CHOP和CASPASE-12 的蛋白及mRNA表达增高，钙网蛋白Calreticulin表达增强。动物模型显示：出现氟牙症组大鼠牙釉质中的成釉细胞排列紊乱，细胞极性消失，个别细胞出现扭曲，细胞之间间隙不规则，Tome突变短或消失。GRP78、XBP-1、CHOP、Caspase-12、Calreticulin均出现棕褐色的阳性表达，且随着饮水氟浓度的增加，阳性表达增强，各组间具有显著差异。本项目研究证实，在牙釉质发育矿化过程中，如果摄入过量氟，则会引起成釉细胞的钙超载，导致细胞内质网应激，出现未折叠蛋白反应。此时XBP-1表达增强减缓内质网应激状态，恢复细胞功能。当氟浓度过高时，内质网应激反应未能恢复，则会激活Caspase-12通路和CHOP因子，从而促进细胞发生凋亡，导致成釉细胞凋亡。由此证明，由成釉细胞内质网应激导致的细胞凋亡是氟斑牙形成过程中不同于线粒体、死亡受体通路的又一重要途径。氟中毒导致细胞钙超载是形成内质网应激的一个重要原因。