基于葡萄霜霉菌效应因子RxLR31197鉴定中国野生葡萄抗病相关基因的研究

Grape Downy Mildew, caused by the pathogen Plasmopara viticola, is one of the most devastating grapevine oomycete diseases worldwide. RxLR effectors play important roles in the interactions between oomycete and plants. Our previous transcriptomic analysis found an RxLR effector, which named RxLR31197. At present study, a PVX-based high-through plant expression system which can block the programmed cell death induced by mouse pro-apoptosis protein Bax and can trigger cell death in Nicotiana benthamiana was used and the key recognition and subcellular localization were analysed to clarify the toxicity and functional site. In the following study, a cDNA library, constructed using diseased leaf tissues of Chinese Wild Vitis. piasezkii ‘Liuba-8’ infected with P. viticola, were screened for proteins interacting with RxLR31197 using a yeast two-hybrid approach. The goals are to identify resistant genes of host plant interacting with RxLR31197 and to investigate on the interaction between oomycete pathogens and their host plant and the disease resistance mechanism at the molecular level. This study facilitates further investigation on translocation of effector and its virulence mechanisms in host plant cells and will facilitate the development of novel disease control strategies.

葡萄霜霉病是由霜霉菌引起的、全球范围内危害葡萄生产的一大卵菌病害。RxLR效应蛋白在卵菌与植物互作中发挥着重要作用。实验室前期的转录组分析发现了一个RxLR类效应因子，将其命名为RxLR31197。本研究首先克隆RxLR31197基因，以小鼠促凋亡蛋白Bax为诱导因子，分析其对Bax诱导的过敏性细胞死亡的抑制作用和诱导烟草细胞死亡的功能。同时对其关键识别位点及亚细胞定位进行分析，明确其毒性功能及其功能位点。然后以RxLR31197为诱饵，筛选葡萄霜霉菌诱导的中国野生复叶葡萄‘留坝-8’叶片酵母表达cDNA文库，获得与其互作的靶蛋白，并通过酵母回复实验、免疫共沉淀及双分子荧光互补进一步验证其互作。初步揭示寄主细胞抗病蛋白与RxLR31197互作的抗病分子机理，推动认识葡萄-病原卵菌互作的分子机制。

葡萄霜霉病是由葡萄霜霉菌引起的、全球范围内危害葡萄生产的一大卵菌病害。RxLR效应蛋白是由病原卵菌分泌的，在卵菌与植物互作中发挥着重要作用。前期我们对葡萄霜霉菌进行基因组测序，通过生物信息学的方法鉴定到了RxLR效应蛋白。然后通过抑制致死实验对这些效应因子进行初步筛选。其中，PvRxLR10是一个重要的效应蛋白，它可以抑制激发子INF1和Bax引起的细胞坏死，干扰寄主免疫反应，促进病原菌侵染。为了进一步探究其功能，我们首先通过酵母双杂交筛选到了其在葡萄中的互作蛋白VvBPA1，并通过酵母回复实验、双分子荧光互补以及免疫共沉淀验证了PvRxLR10与 VvBPA1的互作。然后我们将PvRxLR10和VvBPA1瞬时转入烟草，对转基因烟草接种辣椒疫霉，通过观察病斑发现PvRxLRR10和VpBPA1转基因烟草均抑制烟草抗病性。同时我们使用TRV-VIGS的方法，获得了BPA1的烟草沉默株系TRV-NbBPA1，接种辣椒疫霉菌到TRV-NbBPA1沉默植株叶片，发现沉默株系叶片ROS累积增高。然后将VpBPA1和PvRxLRR10分别瞬时转化到TRV-NbBPA1沉默植株，接种辣椒疫霉。发现转化VpBPA1到沉默株系后，ROS累积减少。转化PvRxLRR10到TRV-NbBPA1沉默株系中，ROS累积与对照无差异。说明，BPA1可能是植物抗病的负调控因子，VpBPA1可以在一定程度上回补烟草中由于NbBPA1沉默产生的ROS累积。而PvRxLRR10发挥病原菌促进侵染的作用可能依赖于BPA1。为了进一步明确PvRxLRR10与VpBPA1的关系，我们进行了体外降解实验，结果表明PvRxLRR10可以稳定VpBPA1不被快速降解。本研究揭示了RxLR效应蛋白与寄主蛋白互作的分子机理，为推动认识葡萄-病原卵菌互作的分子机制提供理论基础。