三角褐指藻Δ4脂肪酸去饱和酶基因的克隆及其DHA合成过程中关键酶功能分析

ω-3 polyunsaturated fatty acids (PUFAs) like EPA and DHA are essential for nutrition and medicine. Which have become the hot point for research and industry development in recent years, and utilizing the gene engineering method to produce PUFAs is a new effective mean. It depends on the study on key enzymes in PUFAs synthesis process. Phaeodactylum tricornutum, the material in this study, is rich in EPA and the genes of key enzymes have been cloned involving in EPA biosynthesis. However, until recently little progress had been made in its transformation process from EPA to DHA. So we will clone the gene of delta-4 desaturase of Phaeodactylum tricornutum, a key enzyme convert EPA to DHA. And we also will analysis the function of key enzymes referred in DHA synthesis by overexpression these genes in P. tricornutum. The completed genome sequencing and mature genetic transformation system is helpful for these researchs. This study will lays foundation for improving the fatty acids content of P. tricornutum and providing the theoretical basis and experimental programs for large-scale production of EPA and DHA.

ω-3族多不饱和脂肪酸（PUFAs），如EPA和 DHA，对人类健康非常重要。目前，利用基因工程方法生产PUFAs已成新的研究热点。但其前提是必须对PUFAs的合成过程中关键酶有所了解。本研究的材料三角褐指藻是一种高效积累EPA的藻种，其EPA合成过程涉及的关键酶基因均已被克隆，但是其EPA向 DHA转化过程的研究直到最近才取得一些进展。因此，本研究利用三角褐指藻基因组测序已经完成以及遗传转化系统较为成熟的优势，拟对其DHA代谢过程中的关键酶Δ4脂肪酸去饱和酶基因进行克隆，并进一步在三角褐指藻内对已克隆的各种DHA合成代谢中的关键酶进行过表达研究，并结合多不饱和脂肪酸的含量变化分析各关键酶的功能。以期为通过对三角褐指藻基因定向改造，获得稳定的转基因株系，调节关键基因的表达水平，为探索提高三角褐指藻DHA产率和优化脂肪酸组成的途径奠定基础。

多不饱和脂肪酸对人类健康非常重要。目前，利用基因工程方法生产PUFAs已成新的研究热点。但其前提是必须对多不饱和脂肪酸的合成过程中关键酶有所了解。本研究针对三角褐指藻EPA向DHA转化过程的关键酶相对研究较少的问题展开研究，研究中利用已知的Δ4脂肪酸去饱和酶的基因序列对三角褐指藻全基因组序列进行检索，获得了三角褐指藻Δ4脂肪酸去饱和酶基因序列，并将其构建到pPha-T1载体中，进行了三角褐指藻的遗传转化；另外我们还对三角褐指藻EPA转变为DHA过程中另一个关键酶Δ5脂肪酸延长酶的启动子进行了分析。分析结果表明，三角褐指藻的Δ5脂肪酸延长酶基因位于1号染色体928330——929265之间，在该基因上游772bp存在另一个基因。因此我们对两个基因间的序列进行了启动子的搜索，分别使用bimas的启动子搜索工具和Promoter 2.0 Prediction Server进行启动子搜索，均未找到启动子信号，这有可能是三角褐指藻中DHA含量较低的原因之一；为弄清三角褐指藻DHA合成过程关键酶基因不同生长时期的表达模式，我们还对Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶和Δ6延长酶的表达模式进行了qPCR分析。结果表明三个基因随三角褐指藻培养时间延长其表达量均呈现增高的趋势。本研究结果是对三角褐指藻多不饱和脂肪酸合成代谢过程的补充与完善。可以为三角褐指藻遗传改造，获得稳定的转基因株系，为探索提高三角褐指藻DHA产率和优化脂肪酸组成的途径奠定基础。