基于耐药转运蛋白的前列腺屏障相关引使药配伍机制研究

中医学有配伍引使药（引方中诸药直达病所的使药）的传统，但尚未见到引使药促进其他药物在前列腺屏障组织分布的实验报道，更未见前列腺相关引使药与耐药转运蛋白相互作用的研究报道。本课题拟采用当归贝母苦参丸（出自《金匮要略》）为示范方剂，从①配伍关系(结合体内药动学、前列腺药物分布及体外单层细胞细胞跨膜吸收实验，确定方剂中的引使药及其配伍关系)；②前列腺细胞耐药蛋白的表达(以单克隆抗体标记转运蛋白、流式细胞仪检测)；③促透途径（BCRP、P-gp等耐药转运蛋白抑制实验）等3个方面综合评判前列腺相关引使药及促透机制，从而建立一套研究前列腺相关引使药及其配伍分布机制的新方法，并起一定的示范作用，为前列腺病灶相关的引使药配伍理论提供实验依据，为临床医治前列腺相关疾病组方用药提供新思路。

摘要：前列腺耐药屏障与耐药蛋白高度相关，并且中医学有配伍引使药（引方中诸药直达病所的使药）的传统，但尚未见到引使药促进其他药物在前列腺屏障组织分布的实验报道。为评价前列腺相关引使药及配伍分布前列腺的机制，本项研究采用当归贝母苦参丸（出自《金匮要略》）为示范方剂，从配伍关系、前列腺细胞转运蛋白的表达和促透机制等方面进行了深入研究。1. 首次应用血清药理学方法证实①苦参含药血清不仅能直接抑制前列腺细胞生长，而且作用温和，不明显改变大鼠前列腺细胞形态。②苦参在方剂中发挥抑制前列腺细胞增殖的君药作用，贝母对苦参的抑制活性具有协同增效作用，发挥佐使药的作用。2. 首次建立该方剂7种成分同时检测的LC-MS/MS定量方法，并应用于各配伍组的药代动力学参数测定，结果发现贝母的配伍可以影响各苦参类生物碱的消除速率并增加苦参碱和槐果碱生物利用度。3. 前列腺组织分布的研究发现，复方配伍可以显著提升苦参类生物碱的前列腺药物分布浓度，并提升部分苦参生物碱的速效、长效作用。4. 体外单层细胞跨膜转运实验和前列腺细胞药代动力学研究，实验证实贝母可以促进苦参类生物碱单向跨膜转运。5. 前列腺耐药蛋白表达及促透途径研究，实验证实贝母促进苦参各生物碱成分在前列腺分布的促透机制与其下调P-gp耐药蛋白的表达有关，在配伍中发挥着引使药作用。6. 首次运用计算机模拟人P-gp蛋白的同源模建，进行模型与药效成分之间的分子对接研究。发现贝母素甲等生物碱通过氢键、疏水和静电相互作用与P-gp间的活性位点紧密结合，进而发挥活性。7. 贝母素甲提取、纯化工艺研究。首次建立了一套可得到高纯度贝母素甲的制备方法。工艺中所用的树脂、溶剂和洗脱剂均可以重复使用，无需甲醇、氯仿等有毒昂贵溶剂，工艺成本很低，适合大规模制备，目前已申请发明专利。其中1、6、7项为原定计划基础上的拓展研究，这些研究结果从多角度论证，贝母在方剂中发挥着引使药的作用，可以提升苦参类生物碱在前列腺屏障组织的分布，促透机制与下调P-gp耐药蛋白的机制有关，原申请书中首次提出（前列腺相关引使药及其配伍分布机制研究）的新思路合理、新方法可行。