龙眼磷脂酶D基因差异表达与果实发育及衰老的关系

龙眼采后衰老褐变与磷脂酶D（PLD）催化细胞膜脂降解导致膜结构改变，从而破坏多酚氧化酶与其底物的细胞内区域化分布格局，引发底物酶促褐变有关。本项目在申请人初步确定催化膜脂降解的关键酶PLD与龙眼衰老褐变密切相关的基础上，从PLD基因家族全长cDNA克隆着手，深入研究龙眼果皮PLD基因家族各成员在果实发育期间的特异性表达，确定各成员与龙眼果实发育和成熟的关系及可能在采后膜劣变阶段起关键作用的PLD成员的表达特征。同时，进一步分析龙眼果实采后衰老期间相关PLD在基因和蛋白水平上的特异性表达，确定在龙眼采后衰老膜劣变过程中起关键作用的PLD基因家族成员。本项研究预期成果可为阐明龙眼果皮PLD基因的差异表达与果实发育和衰老的关系提供重要依据，并为进一步研究通过调控PLD基因的特异性表达来延缓龙眼衰老褐变奠定基础。

本项目针对龙眼磷脂酶D（PLD）基因差异表达与果实发育及衰老的关系进行了研究。克隆得到“石硖”龙眼磷脂酶D基因家族PLDα、β、δ cDNA全长并登录NCBI，GenBank登录号分别为HQ833033.1、HQ667666.1、JF791814.1。对龙眼PLD基因家族推导的氨基酸序列一级结构分析发现龙眼PLDα、β、δ与其他植物PLD基因家族序列类似，都含2个磷脂酶D的标志序列H×K××××D基序(HKD基序)，为催化水解的活性部位；二级结构分析发现龙眼PLDα、β、δ 在N端都具Ca2+结合的C2结构域，说明PLDα、β、δ活性均受Ca2+浓度调控；PLDα、β、δ的氨基酸序列中均发现保守的“IYIENQFF”基序，且该基序中的苯丙氨酸均被亮氨酸取代。龙眼PLDα、β、δ 在三级预测空间结构上具较大差异，但PLDα、β、δ的HKD基序均位于结合域内部，且通过空间折叠其位点在结合域内形成位置接近的夹角。PLDα、β和δ基因在发育期幼果的合子胚、心形胚和鱼雷胚表达呈上调趋势，其中PLDδ基因的上调表达最为明显。PLDα和β基因在成熟果中随果实的衰老都具有上调表达趋势，PLDα的表达累积高于PLDβ，PLDδ基因在采后衰老的果实中不具有明显的上下调表达趋势。PLDα及PLDδ主要在采后龙眼果肉中作用，而PLDβ则主要在采后龙眼果皮中作用。本项目初步提出通过上游调控PLD基因表达，下游调控酶促氧化反应与膜脂过氧化，从而延缓货架期龙眼衰老褐变的新思路。