三角褐指藻岩藻黄素合成路径解析

It is of great interest to develop elite diatom strains featured with high fucoxanthin content by genetic engineering. However, the implementation of this strategy is heavily hindered by the poor understanding about the biosynthetic pathway of fucoxanthin. After conducting deep analysis of the genome data of several diatom species and systematic arrangement of the latest achievements achieved in the fields of carotenoid, the proposer found that related research progress can provide important clue for the clarification of biosynthetic pathway of fucoxanthin. Phaeodactylum tricornutum, featuring available genetic manipulation tools and high quality genome data, is a model organism of diatom. Therefore, this project intends to solve the following key scientific problems in P. tricornutum. Is neoxanthin the precursor of fucoxanthin? What is the pigment intermediate between neoxanthin and fucoxanthin? Which genes are responsible for the neoxanthin synthase and fucoxanthin synthase, respectively? Do neoxanthin synthase and fucoxanthin synthase play key roles on the biosynthesis of fucoxanthin? This project, with huge application foreground and great scientific significance, can solve many mysteries related to the biosynthetic pathway of fucoxanthin, and provide guidance for the application of genetic engineering in the field of fucoxanthin production.

岩藻黄素极具开发潜力，通过基因工程手段构建高产岩藻黄素藻株是炙手可热的研究课题。然而，对岩藻黄素合成路径认知匮乏及关键酶不明，严重阻碍这一策略的实施。申请人对硅藻基因组信息进行深入分析、并对类胡萝卜素领域最新成果进行系统梳理后发现，相关进展能够为岩藻黄素合成路径解析提供重要线索。三角褐指藻基因组数据质量高，遗传工具完备，可作为模式物种开展岩藻黄素相关研究。因此，本项目选取三角褐指藻为实验材料，拟通过Crispr/Cas9、RNA干扰、过量表达等手段，解决如下关键科学问题：新黄素是否为岩藻黄素合成前体？新黄素与岩藻黄素之间的中间体是何色素？新黄素合成酶、岩藻黄素合成酶分别由何基因编码？两者是否为岩藻黄素合成的关键酶？本项目的开展，不仅能够解开岩藻黄素合成路径中的诸多谜团，且能够为基因工程在岩藻黄素领域的应用提供指导。

岩藻黄素具有抗肥胖、抗阿尔茨海默症、抗肿瘤等众多医药活性，极具开发价值。三角褐指藻生长速度快、岩藻黄素含量高、有规模化培养基础，是生产岩藻黄素的优质来源。以岩藻黄素合成关键基因为基础，借助合成生物学手段对三角褐指藻进行种质改良，可充分提高岩藻黄素含量。然而，岩藻黄素合成路径仍有多个步骤未解，导致该策略难以推进。针对该问题，本项目对三角褐指藻岩藻黄素合成相关的多个酶基因进行了预测并借助过表达、敲低、敲除、原核表达等手段对这些酶基因的功能进行了验证。发现：（1）PtABA4过表达、敲低、敲除之后，三角褐指藻的岩藻黄素含量分别表现出提高、降低、降低的趋势；同时，上游色素的变化趋势与岩藻黄素趋势一致。然而，对PtABA4进行原核表达、提纯之后发现该蛋白缺乏合成新黄素的能力。这些结果表明，PtABA4确实参与了三角褐指藻的类胡萝卜素合成和积累，但并不负责新黄素合成。（2）PtCRTISO4过表达、敲低、敲除同样导致三角褐指藻的岩藻黄素含量发生变化，且变化趋势与PtABA4一致；体外功能验证进一步证实PtCRTISO4同样参与三角褐指藻岩藻黄素合成。（3）我们在研究过程中发现，三角褐指藻存在7条假定CRTISOs，而高等植物仅有1-2条。鉴于岩藻黄素合成相关的多个酶基因仍不明确，我们推测这些假定的CRTISOs极有可能发挥变构酶之外的功能。于是，我们借助敲除、亚细胞定位、质谱和核磁等手段对所有PtCRTISOs的功能进行了系统研究。发现，将其中一条假定CRTISO敲除之后，三角褐指藻由黄褐色转变为绿色；结合原核表达、质谱和核磁等数据，该CRTISO确定为岩藻黄素合成酶。如上，依托本项目，我们借助丰富的技术手段，大幅度拓展了对岩藻黄素合成路径的认知；同时也为基于合成生物学手段构建高产岩藻黄素藻种奠定了基础。