利用模块化间隔序列调控人工操纵子构建细胞工厂产琥珀酸的研究

利用微生物合成的方法生产生物基化学品是目前绿色化工的发展趋势。琥珀酸位列美国能源部批示的12种生物基大宗化学品之首。迄今提高大肠杆菌工程菌的琥珀酸生产能力的研究集中在单个关键基因的导入，但能否实现多个关键基因在细胞内的协同表达以获得多方面优势均增强的工程菌株的研究甚少。本项目根据化工单元操作与优化的原理，通过构建人工操纵子，实现以单个基因为单元，多个基因的共表达；通过PCR的方法建立基因间隔序列的模块化寡核苷酸片段库，将不同的的转录后调控元件进行组合，筛选所期望的表达水平；将达到所期望表达水平的间隔序列的组合插入人工操纵子，以优化多个外源基因的表达水平，获得生长力强，且琥珀酸生产能力提高的工程菌株。本研究的目的是探索如何在合成人工操纵子中优化多基因的表达，构建可高效转化生物质生产琥珀酸的细胞工厂，并将为其它需要引入多个基因重构细胞代谢网络的研究提供借鉴，具有原核和真核细胞的普适性。

本课题旨在建立基因间隔序列库优化人工操纵子中多基因的表达，构建可高效转化生物质生产琥珀酸的细胞工厂，为其它需要引入多个基因重构细胞代谢网络的研究提供借鉴。本课题研究了琥珀酸合成途径中的关键酶基因过量表达对琥珀酸生产的影响，构建了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、碳酸酐酶、丙酮酸羧化酶共表达的人工操纵子；通过PCR法建立了基因间隔序列寡核苷酸片段库，将不同的转录后调控元件进行组合，筛选到了可理性控制基因表达水平的基因元件；将该调控元件插入人工操纵子中，通过协调基因表达水平， 实现了琥珀酸高生产强度、高收率的制备。针对RBS结合位点和基因翻译起始点ATG之间的序列进行调控，最终摇瓶发酵琥珀酸产量可达26.1 g/L，得率为0.87 g/g，生产率为2.01 g/L-h。此外，课题还对离子液体催化生物质水解获得可发酵单糖，采用工程菌发酵废弃物木糖母液产琥珀酸进行了研究，以降低琥珀酸发酵生产成本。本课题实施过程中共发表期刊论文20篇，其中SCI收录14篇，核心期刊收录 1篇，会议论文5篇，作邀请口头报告3次，申请发明专利6项，其中2项授权，共培养硕博士研究生8名。课题组经过三年的努力，圆满完成了研究任务，达到了预期的研究目标。