利用时间序列转录组构建番茄嫁接愈合的基因调控网络

The regulatory mechanisms of graft healing are receiving increasing attention to deal with the problem of low healing efficiency in graft vegetable seedling production. In previous studies, several co-expressed gene clusters were found to participate in the regulation of graft healing in tomato. However, the patterns of how the genes interact and compose the Gene Regulatory Network (GRN) are still not clear. In this proposal, we will construct the graft healing-related GRN in the graft union of tomato, including the GRNs in scion and stock respectively, and the interaction GRN between scion and stock. By dense sampling of stem sections above and below the cut position and transcriptome sequencing (RNA-Seq), data will be computed using three algorithms—Time-Delay Correlation (TDCor), GEne regulatory Network Inference from SpatioTemporal data (GENIST), and Sliding Window Inference for Network Generation (SWING)—then a consensus GRN will be generated. Yeast-one-hybrid (Y1H) technology will be used to validate the regulatory functions of transcription factors with high hubness. This effort will provide systematic understanding of graft healing mechanisms and provide guidance for grafting of solanaceous vegetables.

为解决蔬菜嫁接苗生产上嫁接愈合（graft healing）效率低下的难题，嫁接愈合调控机制的研究愈发受到关注。前期研究表明，番茄嫁接愈合由若干共表达基因集参与调控，然而各基因之间组成基因调控网络（Gene Regulatory Network，GRN）的模式并不明确。本项目拟利用时间序列（time-series）转录组，以生物信息学手段构建番茄嫁接愈合相关的GRN，包括嫁接结合部接穗和砧木中各自的GRN，以及砧穗间互作的GRN。通过对切口上、下茎段在完整愈合期的密集时间序列取样和转录组测序（RNA-seq）获得数据，分别运用时滞相关性（TDCor）、时空数据动态贝叶斯网络（GENIST）、时间滑窗回归（SWING）三种算法计算，并提取其中的一致性GRN；选择处于核心位置的转录因子以酵母单杂（Y1H）技术验证结合调控功能。项目的实施将有助于系统地理解嫁接愈合机制，指导茄果类蔬菜的嫁接应用。

嫁接能够为接穗带来明显的性状增益，在果菜类蔬菜的栽培中被广泛应用。为解决生产中嫁接愈合效率低下的难题，亟需弄清砧穗的愈合调控机制。以往研究发现，番茄嫁接愈合由若干共表达基因集参与调控，然而处于同一共表达基因集的基因调控网络（Gene Regulatory Network，GRN）并不明确。项目对番茄嫁接结合部的接穗和砧木茎段进行了密集的时间序列（time-series）取样和转录组测序，并对数据进行了深入挖掘分析。UMAP降维将不同部位和不同时间点的样本转录组区分到二维平面，接穗和砧木样本在愈合初始时差异最大，之后随愈合进程逐渐相互趋近，并趋向于完整茎段样本。使用层次聚类将所有基因的表达模式归为14个聚类，再使用自组织映射聚类继续获得100余个子聚类，GO注释表明其中多个子聚类与表型变化密切相关，包括形成层活动、细胞壁重组、维管束分化等。针对重点子聚类的基因集，以时滞相关性（TDCor）、时空数据动态贝叶斯网络（GENIST）、时间滑窗回归（SWING）三种算法构建嫁接愈合相关的GRN，获得了嫁接结合部接穗和砧木中各自的GRN，以及砧穗间互作的GRN。参与维管束分化的功能基因处于调控网络核心位置，如PEAR1、PEAR4、WOX4、VND6等。使用分子生物学方法对处于网络枢纽位置转录因子基因的表达部位进行验证，明确了不同基因在维管束组织的特异性表达。本研究在时间和空间尺度上揭示了番茄嫁接愈合的基因表达及其调控，并获得了多个有深入研究价值的核心基因。对于系统地理解嫁接愈合机制，指导果菜类蔬菜的嫁接应用具有重要的借鉴意义。