基于产油酵母构建生产羟化脂肪酸细胞工厂的研究

Long-chain hydroxyl fatty acids (LHFAs) are indispensable precursors in paint and lubricant industries, however, the resources of LHFAs are limited. Currently, LHFAs are produced through extraction from plants, chemical synthesis or whole-cell biotransformation. These approaches suffer from a number of issues, including limited resources, complex processes, high energy consumption and inefficiency. Oleaginous yeasts are endowed with strong de novo fatty acid biosynthesis pathway. In the present proposal, we are to engineer the oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides by introducing enzymes for production of LHFAs. We first express genes encoding enzymes for production of hydroxylated fatty acids in R. toruloides, the toxicity of LHFAs are reduced by introducing LHFAs preferred triglyceride lipases and phosphases, then the endogenous lipid synthesis pathway is down regulated by using RNAi technology. Finally, the cultivation parameters are optimized through single- and multiple-factor experiments. The results would launch fundamentals for oleaginous yeast based cell factory for value-added fatty acid derivatives and of great significance for improving the economics of microbial oils.

长链羟化脂肪酸是生产油漆和高档表面活性剂等油脂化工产品的基础原料。当前基于蓖麻油提取、化学合成和全细胞催化转化等技术制备LHFAs，不同程度存在原料产量低、工艺复杂、能耗高或效率低等问题，不能满足市场需求。产油酵母能以碳水化合物为原料，高效合成油脂，但酵母油脂经济性差。针对上述问题，本项目拟以Rhodosporidium toruloides为宿主，构建LHFAs细胞工厂。首先，选择编码羟化脂肪酸合成相关酶的基因，构建表达载体，实现其在R. toruloides中有效表达；通过表达偏好LHFAs的脂肪酶或磷脂酶，提高底盘细胞的产物耐受性。其次，利用RNA干扰技术下调内源油脂合成下游代谢途径，增加LHFAs合成前体脂肪酰-CoA供给。最后，优化工程菌株培养条件，提高LHFAs产量。研究成果将为构建高值脂肪酸衍生物细胞工厂奠定科学基础，对改善微生物油脂的经济具有重要参考价值。

项目背景：长链羟化脂肪酸（long-chain hydroxy fatty acids，LHFAs）是生产油漆和高档表面活性剂等油脂化工产品的基础原料。当前基于蓖麻油提取、化学合成和全细胞催化转化等技术制备LHFAs，存在原料产量低、工艺复杂、能耗高、效率低等突出问题，不能满足LHFAs市场需求。产油酵母能以碳水化合物为原料高效合成脂肪酸组成与植物油相似胞内油脂，其中油酸含量可达到60%左右，是合成12-羟基油酸、10-羟基硬脂酸的底物；硬脂酸，亚油酸在10%左右，分别18-羟基硬脂酸和11-羟基亚油酸的前体。因此，本项目采用代谢工程策略改造产油酵母Rhodosporidium toruloides构建LHFAs细胞工厂。.研究内容：首先，从头合成源于蓖麻、麦角菌菌等脂肪酸羟化酶、水合酶和脂氧合酶的原始mRNA序列和根据R. toruloides密码子偏好性优化序列，构建生产蓖麻油酸、11-亚油酸羟基脂肪酸、10-羟基硬脂酸等的R. toruloides工程菌；通过表达偏好LHFAs的脂肪酶或磷脂酶，降低其对底盘细胞的毒害作用。其次，利用RNAi技术下调内源油脂积累下游代谢途径，以增加LHFAs合成前体脂肪酰-CoA的供给；最后，采用高密度发酵策略，发酵工程菌生产羟基脂肪酸。.重要结果：研究发现游离蓖麻油酸、10-羟基硬脂酸等对R. toruloides具有较强的生物毒性，以其作为唯一碳源，细胞不能同化利用相应脂肪酸；12-油酸羟化酶、P450羟化酶具有多个跨膜结构，直接在R. toruloides表达存在困难，导致蓖麻油酸在工程菌油脂中含量极低，仅能通过固相微萃取检测；油酸水合酶能够催化10-羟基硬脂酸的合成，在工程菌油脂中的含量为1.5%，产量达到1 g/L，油酸水合酶同时能够催化9,10-二羟基硬脂酸的合成；采用RNAi策略能够将R. toruloides内源脂肪酸合酶表达水平下调11%至92%，同时R. toruloides细胞生长速率最高也会下降80%；过表达外源磷酸转乙酰基酶（WP_003243393.1）能够将R. toruloides葡萄糖消耗速率、生物量和油脂含量分别提高33.3%、27.1%和7.6%；.科学意义：研究成果将为构建基于产油酵母的高值脂肪酸衍生物细胞工厂奠定科学基础，对改善微生物油脂的经济性具有重要参考价值。