利用非同源末端连接的基因组精简策略构建最适细胞工厂

Defining and constructing a minimal genome not only improves our understanding of microbial adaptation and evolution, but also revolutionizes our toolbox for biosynthesis. However, current available genome reduction approaches are limited to homologous recombination-based method, which restricting rapid, large-scale application. In this study, we are aiming at developing a novel strategy for genome reduction taking advantage of the non-homologous end-joining (NHEJ) mechanism. Previously, we reported that prokaryotic NHEJ sufficiently mediates genomic DNA double-strand breaks repair and introduces random DNA excision at junction site in E. coli. In addition, the resulting DNA-excision is up to regulation of given NHEJ system or combination of the NHEJ components. Employing the CRISPR-Cas9 system to introduce genomic DNA double-strand breaks, the NHEJ is of great potential to construct proposed optimized microbial cell factory by introducing genomic deletion efficiently and rapidly. Designing and synthesizing an sgRNA library that covers the whole genome facilitates construction of genomic scale mutant library with random deletions. Coupling with continuous reduction processes of random DNA-excision and selective breeding, we can ultimately obtain desired mutants with optimized genome size. In addition to its application to biosynthesis, such optimized microbial cell factory will broaden current theory of microbial evolution.

细菌最小基因组的构建对于探索微生物环境适应性进化的生物学基础理论具有重要意义。但目前基因组精简方法都是基于同源重组的DNA删除，难以快速和规模化。最近，我们在原核生物中开发了基于非同源末端连接（non-homologous end-joining, NHEJ）的基因组断裂修复系统，并发现该修复会伴随不同长度DNA片段的随机缺失，而缺失片段的大小可以通过不同类型的NHEJ系统及各组分的表达进行调控。基于上述原理，本项目提出了生物合成“最适”细胞工厂理论的基因组快速删除策略，即结合CRISPR-cas9介导的基因组断裂，设计合成基因组规模的sgRNA文库，通过NHEJ的错误修复获得基因组DNA随机删减的突变体库。进一步对突变库进行连续迭代删除和针对某种产物或特定环境的进化筛选，从而获得含有精简基因组的“最适”细胞工厂。这不仅可以探索基因组适应性进化的基础理论，还对生物合成具有重要应用价值。

基因组精简能够降低微生物基因组的复杂性，增加基因线路的可预测性和可操作性，是合成生物学中构建“最适”的微生物细胞工厂重要策略。但是，目前基因组精简都是基于同源重组（Homologous Recombination，HR）的靶向基因敲除，该过程需要向微生物细胞引入同源DNA修复模板，且一次只能在基因组特定位置删除一个DNA片段，难以实现规模化。非同源末端连接（Non-Homologous End Joining，NHEJ）体系能够直接修复基因组双链断裂（Double strands break，DSB）不需要外源的DNA修复模板，并且修复过程会随机删除不同长度的DNA片段，而删除片段的长度可以通过表达不同类型的NHEJ系统及组分进行调控。.综合以上，本项目提出了NHEJ介导的基因组精简策略以构建特定环境下“最适”的微生物细胞工厂。首先，通过生物信息学分析原核NHEJ体系的物种分布及分子进化特征，我们发现结合分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mt）来源的NHEJ能够有效修复大肠杆菌基因组DSB。并且，在大肠杆菌中单独表达T4 DNA连接酶也能替代MtNHEJ修复DSB。另外，大肠杆菌虽然不存在NHEJ体系，但是也有一个不依赖HR的末端连接机制（Alternative end-joining，A-EJ）。基于以上3种DSB修复方式，我们在大肠杆菌中建立了3种不依赖HR的大片段删除的策略，实现基因组特定位置不同长度的DNA片段删减。随后，我们结合转座子插入突变与基因组大片段删减策略，在大肠杆菌中建立了转座子介导的随机基因组精简（Transposon mediated random deletion, TMRD）系统，实现了随机位置不同长度的基因组大片段删除。最后，为了工程大肠杆菌高效生产聚羟基丁酸酯（Polyhydroxybutyrate，PHB），我们偶联TMRD与PHB的生物合成，筛选高产PHB的基因组简化的菌株。最终获得5株生长、电转化、葡萄糖利用和PHB生产提高的菌株，证明基因组精简在构建 “最适”的流线型微生物细胞工厂的应用潜力。