兼有靶向和调控自噬功能的GnRHa-纳米载药系统在顺铂耐药卵巢癌中的治疗作用和机制研究

Autophagy is an important mechanism for the resistant to platinum drugs in ovarian cancer treatment. The expression of Gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) receptor in ovarian cancer is very high so that GnRH receptor is an ideal candidate for targeting drug delivery for treatment of ovarian cancer. In the previous studies, we for the first time showed that supramolecular nano vesicles loading GnRH analogs significantly eliminated the cisplatin-resistance in human ovarian cancer cells. Moreover, we found that the modulation on autophagy may contribute to this effect of GnRH analogs-conjugated nanometer particles. However, this therapeutic action of GnRH analogs-conjugated nanometer particles needs to be verified in vivo and further investigation. In this proposal, we intend to perform the following studies: (1) generating GnRH analogues-conjugated nanoparticles targeting ovarian cancer using mesoporous silica nanoparticles and lipid nanoparticles as drug carrier for in vivo study; (2) investigating the anti-cancer action of GnRH analogues-conjugated nanoparticles targeting ovarian cancer in vivo model using transmission electron microscope, flow cytometry, transwell chamber and etc; (3) exploring the potential mechanisms underlying the overcoming of platinum resistance in ovarian cancer, such as the regulation on autophagy by the GnRH analogues-conjugated nanoparticles. This project may provide new perspectives for the therapeutic value of GnRH analogues-conjugated nanoparticles in platinum-resistant ovarian cancer.

顺铂耐药是卵巢癌治疗中亟待解决的难题。近年来，靶向抗肿瘤药物发展迅速，其中，构建高靶向纳米药物成为克服卵巢癌耐药的重要策略。我们在前期已发现促性腺激素释放激素类似物（GnRHa）在耐药卵巢癌细胞上有显著抑癌作用，可能与其阻断自噬流有关。而卵巢癌上高表达GnRH受体，故GnRHa亦可作为极佳的靶向基团与其结合，引导纳米药物特异靶向卵巢癌细胞。本课题拟开展以下工作：（1）以介孔二氧化硅MSNs纳米粒和DOPA脂质体为载体，构建顺铂-MSNs-GnRHa和顺铂-DOPA-GnRHa两种新型纳米给药系统；（2）在动物荷瘤模型上，全面考察这两种靶向纳米药物对耐药卵巢癌的靶向性、抗肿瘤作用；（3）围绕“自噬流”机制，系统探讨GnRHa介导的靶向纳米药物克服卵巢癌顺铂耐药的关键分子机制。本项目有望阐明GnRHa介导的新型纳米靶向给药系统在耐药卵巢癌治疗中的应用价值和分子机制，具有重要的科学和临床意义。

本项目成功构建核壳式磁性介孔二氧化硅纳米复合物，合成的MMSN形貌规整，介孔特征显著，具有较高的比表面积和孔容，丰富且排列有序的介孔孔道可以高效负载药物，具备较强的超顺磁性和磁靶向性，是理想的纳米靶向载药体系。基于MMSN设计制备了GnRH受体靶向介孔硅纳米复合物Pt(IV)@MMSN@GnRH-a，该纳米复合物中Pt(IV)的载药量为17%，pH 7.4条件下Pt药物的累积释放率约41.4%。磁滞回线显示纳米复合物Pt(IV)@MMSN@GnRH-a仍具有良好的超顺磁性，能发挥磁靶向作用。选用卵巢癌细胞A2780及其顺铂耐药细胞A2780/CDDP为受试细胞，利用激光共聚焦荧光显微镜观察到靶向载药纳米复合物能有效被A2780和A2780/CDDP细胞摄取，具有GnRH-a靶向作用，在外界磁场作用下具有明显的磁靶向性。Pt(IV)@MMSN@GnRH-a纳米复合物对两种细胞的抑制作用均存在浓度依赖性，对A2780/CDDP细胞的毒性作用优于单独给药组，这与细胞凋亡检测结果相一致。通过细胞划痕实验，初步证实Pt(IV)@MMSN@GnRH-a纳米复合物能有效抑制卵巢癌细胞的迁移，且随着浓度的增加，抑制作用更显著。以上结果说明该靶向载药纳米复合物具有良好的抗肿瘤效果和一定的逆转耐药作用。建立顺铂耐药卵巢癌裸鼠移植瘤模型，经尾静脉给予不同的药物处理后，普鲁士蓝染色检测结果体现了靶向载药纳米复合物具有一定的体内磁靶向性。HE染色结果表明顺铂前药和靶向载药纳米复合物的体内毒副作用小。通过观察裸鼠体重、肿瘤体积、肿瘤重量及生存周期来考察靶向载药纳米复合物对顺铂耐药卵巢癌的体内抗肿瘤作用。结果显示Pt(IV)@MMSN@GnRH-a纳米复合物组裸鼠体重较稳定，肿瘤体积和重量均小于生理盐水组、顺铂前药组和顺铂原药组，且显著延长裸鼠的生存时间。综上，本项目成功构建了具有GnRH受体靶向介孔硅纳米复合物Pt(IV)@MMSN@GnRH-a，该体系具有良好的磁靶向性和GnRH-a靶向双重作用，能有效被A2780细胞和A2780/CDDP细胞摄取，在体内外均表现出良好的抗肿瘤活性，具有克服卵巢癌细胞顺铂耐药和降低毒副作用的能力。本研究有望为顺铂耐药卵巢癌的治疗提供新方法和新思路，解决临床治疗中的重要问题具有一定的科学意义。