水稻叶片类病变坏死调控基因LMS1的图位克隆及功能分析

Partial cell necrosis in lesion mimic mutants is a type of programmed cell death and this genetic defect often leads to plant disease resistance enhancement and defense genes constitutive expression. But the exact molecular biological mechanism of plant lesion mimic is varied but not well understood, many related new gene has not yet been identified. Mutant is a good test material for new gene clone and gene function analysis. Here we isolated a rice lesion mimic mutant lms1 (lesion mimic and senilism 1) with spreading cell necrosis through all growth stages, and make research about the phenotypic identification, disease resistance testing and genetic analysis. Furthermore, using molecular marker technology including SSR and Indel etc, we try to map-based clone the target gene LMS1 and make transgenic complementary verification. In addition, we would like to find out the biological function of gene LMS1 with the aid of the method of molecular biology technology, and discuss the molecular mechanism of the cause of rice leaf tissue necrosis. We think this research will help to reveal the regulator mechanism of plant programmed cell death and plant resistance defense signal transmission.

植物类病变突变体中的局部组织坏死是一种自发形成的程序性细胞死亡，这种遗传上的缺陷往往会导致植物对病原菌的抗性增强和防卫相关基因的组成型表达。然而植物类病变的发生机理复杂多变，目前还难以完全揭示，还有许多与之相关的新基因尚未被分离鉴定出来，而突变体是挖掘新基因、研究基因功能的良好试验材料，本研究以一个扩展型全生育期的水稻类病变突变体lms1（lesion mimic and senilism 1）为材料，对其进行表型鉴定、遗传分析；并应用SSR、Indel等分子标记技术对目标基因LMS1进行精细定位、图位克隆和转基因互补验证；借助分子生物学的方法技术来深入研究基因LMS1的生物学功能，探讨其导致水稻叶片组织类病变坏死的分子机制，以期为揭示植物程序性细胞死亡的调控机制以及植物抗病防卫信号传递途径奠定基础。

植物类病变突变体中的局部组织坏死是一自发形成的程序性细胞死亡，这种遗传上的缺陷往往会导致植物对病虫的抗性增强以及防卫基因的组成型表达，因此类病变突变体不仅被用作解释细胞死亡信号途径和植物抗性机制的重要模型，同时对选育抗病性状的农作物品种有积极的推动作用。本研究中我们分离鉴定到一个扩展型全生育期的水稻类病变突变体lms1，细胞学鉴定显示其叶片的类病变坏死属于程序性细胞死亡，同时伴随有活性氧和胼胝质的大量积累；叶片遮光实验显示突变体中的细胞死亡受光照强度诱导。遗传分析表明lms1突变体是个单基因隐性突变体；通过精细定位我们将目的基因定位在2号染色体短臂端的55Kb区间内，测序发现LOC_Os02g02000在编码区509个核苷酸后面插入一个1896bp的片段，最终导致基因功能缺失。转基因互补实验也证明突变体的类病变表型是由于LMS1的插入失活引起的。蛋白序列比对发现LMS1编码脂氢过氧化物裂解酶（OsHPL3），是脂氧合酶（LOX）途径下游的一个重要分支途径的关键起始酶，能够特异性催化亚麻酸过氧化物13-HPOT的裂解反应，生成绿叶挥发物（GLVs）。GC-MS检测发现，与野生型相比，突变体中OsHPL3功能缺失导致叶片中GLVs（（E）-2-己烯醛和（Z）-3-己烯醇）的含量大幅减少，而过氧化脂质的含量显著升高，说明OsHPL3的功能缺失时会造成其直接催化底物13-HPOT的大量积累，进而导致叶片细胞中过氧化总脂含量的显著增加，诱发叶片类病变坏死的发生，这也意味着来自LOX的直接催化产物过氧化脂质并不能被完全重新分配入其它LOX下游分支路径。然而突变体中LOX-AOS代谢支路产物茉莉酸（JA）的含量则显著升高，说明当OsHPL3功能缺失时，其代谢底物13-HPOT有可能重新分配进入其他代谢通路，导致AOS通路的底物增加，从而促进茉莉酸的合成。以上这些结果说明，植物中LOX-HPL代谢途径代谢异常能够诱发类病变坏死的发生，并且植物脂氧合酶下游的AOS和HPL代谢支路间既相互独立，又存在代谢底物的相互竞争和交流。