小分子FC9致其靶蛋白IFN-γR失能的化学基础及对免疫炎症的治疗学意义

Our previous study has found the small compound FC9 from FC analogs with a selective inhibition on IFN-γ signaling. The target protein of FC9 is proved to be IFN-γR in preliminary experiments. This is the first small molecule inhibitor of IFN-γR. In the present study, we will confirm the binding of FC9 to IFN-γR by SPR or ITC assays and examine the characteristics of FC9 against IFN-γ signaling including the intensity, selectivity and underlying mechanisms. Then, we will examine the structural properties of FC9 analogs to bind to the extracellular domain of IFN-γR, and characterize the binding sites by using computer docking, truncated peptides, and amino acid mutations. We also want to explore the process of IFN-γR internalization and endocytosis and to determine the changes in protein conformation by NMR, circular dichroism spectra and atomic force microscope. Finally, we will compare the effects of FC9 on the related immune disease models in wild type and IFN-γR knock out mice and give a new insight for this novel IFN-γR inhibitor to the therapy of immune diseases.

前期研究从系列化合物中发现FC9具有选择性抑制IFN-γ信号的独特作用，初步证实其靶蛋白是IFN-γR，为第1个IFN-γR的小分子抑制剂。本项目拟用多种方法确定FC9与IFN-γR的结合，在此基础上考察FC9对IFN-γ信号的抑制作用强度、选择性及调控IFN-γ/IFN-γR/STAT1通路的环节。进一步用SPR、ITC等手段证实FC系列化合物与IFN-γR胞外区结合的构效关系，借助计算机模拟、肽段截短法和点突变法等确定FC9与IFN-γR的结合位点；探讨FC9导致IFN-γR内吞后的细胞分子过程，利用核磁共振法、圆二色谱法和原子力显微镜等探讨并揭示FC9与IFN-γR的结合及结合后受体构象改变等化学基础。最后，比较野生型和IFN-γR敲除小鼠FC9对于相关免疫性疾病模型药效的差异，探讨新型IFN-γR抑制剂对于治疗T细胞相关免疫性疾病的意义，为这些难治性疾病提供合适的药物作用靶标

选择性调节IFN-γ信号转导是治疗Th1介导的免疫性疾病的有效策略之一。我们的前期研究发现烟曲霉文丙（Fumigaclavine C, FC）具有显著改善免疫性肝炎和免疫性肠炎的疗效，通过改构及活性筛选，我们得到了可选择性抑制IFN-γ分泌而不影响淋巴细胞增殖以及IL-2分泌的化合物FC9，后者可显著改善TNBS诱导的小鼠结肠炎。随后考察了FC9的作用靶点，采用原子力显微镜的研究发现，FC9可直接阻断IFN-γ与IFN-γR1的结合，通过计算机模拟对接，发现FC9可与IFN-γR1相互作用。进一步构建IFN-γR1胞外段的表达质粒，表达纯化后得到的蛋白用于等温量热滴定实验，直接证实了FC9与IFN-γR1之间存在较强的结合，这是迄今为止发现的第1个IFN-γR小分子抑制剂。本研究从FC系列衍生物中得到的化合物FC9显示了针对IFN-γ信号的独特作用，其靶向IFN-γR的特征可望有助于阐明受体大分子失能的分子机制，更可为运用小分子抑制剂主动调控受体蛋白命运从而治疗免疫性疾病提供新的策略。