鱼类小清蛋白聚合特性改变对其致敏性的影响及机理研究

Fish, as one of the eight kinds of allergen sources,has recently received increasing attention around the world.However, no effective processing was available to eliminate its allergenicity at present. Parvalbumin is the major allergen in fish with one to five different isoforms. Previous research indicates that the aggregation propensity is different among parvalbumin isoforms and has some effect on the allergenicity. However, the detail relationship between aggregation and allergenicity of parvalbumin is still not clear, and the structural basis of different aggregation patterns and underlined mechanisms of the effect of aggregation on the allergenicity of parvalbumins are poor understood. Therefore,in the present study, the relationship between the aggregation propensity and allergenicity will be investigated by SDS-PAGE, circular dichroism spectroscopy, and inhibition ELISA. MALDI-TOF/MS together with protease digestion, and fluorescent labeled lectins will be used to investigate the existence of disulfide bonds and glycosylation. Furthermore, comparison between natural parvalbumin and recombinant parvalbumin would be carried out to verify the effect of posttranslational modification on the aggregation propensity. Meanwhile, different food processing methods including Maillard reaction, reduction, and thermal processing will be employed here to investigate the effects of disulfide bonds and glycosylation on the aggregation propensity and thereby the allergenicity of parvalbumins. The variation on digestibility, the Calcium binding ability, and the IgE-binding capacity of parvalbumin isoforms will also be determined to reveal the potential mechanisms of the impact of aggregation controlling on the allergenic properties of parvalbumins.

随着我国水产业的不断发展，鱼类蛋白在我国国民营养供给中的比例逐步增加。但鱼类作为八大类过敏食物之一，目前仍无有效的方法可消除其致敏性，这不仅带来了严重的食品安全问题，还在一定程度上影响了对鱼类过敏人群的饮食质量。本课题组前期研究发现，鱼类主要过敏原小清蛋白异构体在聚合特性上存在差异，该差异与致敏性的变化存在密切关联，但这种关联的规律、结构基础及作用机理尚不明确。本项目拟采用圆二色谱、酶切联合MALDI-TOF/MS、抑制性ELISA等分析手段，首次深入分析美拉德反应、还原、加热等加工处理条件下，鱼类小清蛋白异构体结构的变化，尤其是二硫键和糖基化修饰的改变对聚合特性及致敏性的影响。本项目旨在阐明不同食品加工方式处理后，小清蛋白聚合特性及致敏性的变化规律，明确小清蛋白聚合特性影响致敏性的结构基础及作用机理，为鱼类食品致敏性的消除及相关制品的开发提供重要的理论依据及技术支撑。

本研究采用盐析、离子交换柱层析、凝胶过滤柱层析等方法从鲢鱼、赤魟肌肉、灰星鲨鱼纯化得到不同的小清蛋白异构体，并对其理化性质进行了分析，表明不同鱼类中的小清蛋白异构体的聚合特性存在明显差异；采用RT-PCR方法，从鲢鱼肌肉中分别克隆得到小清蛋白的基因序列，将目的基因片段连接到pET28a (+)表达载体，并在大肠杆菌(E.coli BL21) DE3中成功诱导表达。优化小清蛋白发生美拉德反应的最适条件，通过采用Tricine-SDS-PAGE、褐变度、溶解性、Dot blot分析美拉德反应产物，确定最易发生美拉德反应的糖种类，糖的最适合添加比例，以及最适合加热时间。确定了葡萄糖、木糖、甘露糖最适的反应条件是小清蛋白 : 糖（w/w）=1:8，在100 ℃条件下加热100 min，美拉德反应过程中糖氧化形成二羟基，二羟基可与蛋白的赖氨酸或精氨酸残基反应，导致蛋白发生交联反应。深入研究分析美拉德反应前后重组鲢小清蛋白聚合特性、免疫活性及消化稳定性的变化， Tricine-SDS-PAGE结果表明美拉德反应后，蛋白迁移率降低，蛋白条带出现扩散，并生成多条高分子量聚合物。糖化前的二聚体在还原剂的作用下消失，糖化后的多聚体在还原状态下仍然存在，表明糖化修饰前，小清蛋白的聚合作用是由于分子间形成了二硫键，糖化修饰后小清蛋白分子间的聚合作用是由共价键引起的。通过扫描电镜（SEM）观察小清蛋白的聚合情况，当小清蛋白发生美拉德反应后，蛋白形成相互交联的网络结构，说明糖化修饰促进了小清蛋白聚合体的形成，而形成的空间位阻可能会影响抗体对抗原表位的识别，而使免疫活性降低。通过分析圆二色谱结果显示美拉德反应对二级结构影响较小，对疏水性影响较大。探索美拉德反应对小清蛋白免疫活性的影响及可能的影响方式，有望为美拉德反应在低致敏性鱼类产品开发中的应用提供依据，具有重要的理论和应用价值。