基于血脑屏障开放的冰片“引药上行”规律及机制研究

冰片对血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）的开放作用已被广泛认可，我们在前期工作中也观察到冰片能促进栀子苷入脑，但其开放机制及作用特点目前还不清楚，另外冰片用于开放BBB的剂量也较混乱，这些问题势必影响冰片组方用药的科学性。本项目利用栀子苷作为对照药物，首先测定冰片对栀子苷脑内浓度的干预，确定冰片最佳剂量。然后通过构建微透析-UPLC-MS分析平台，实时监测大鼠不同脑区中栀子苷浓度，获取脑内药动学参数，通过冰片的干预以获得其开放BBB的规律。最后为了揭示冰片开放BBB的药效学机制，除了观察不同脑区BBB超微结构的改变，还采用免疫组化、免疫印迹杂交等分子生物学技术测定BBB功能蛋白-ATP结合盒超家族转运蛋白/mRNA的表达。这一研究成果不仅将为神经系统疾病的药物治疗带来新的策略，而且对于阐明冰片"引药上行"规律具有重大意义。同时也为中医归经理论研究提供一种新思路。

我们在研究中有如下发现：（1）对冰片给药剂量和给药时间进行优化筛选，发现大鼠灌胃冰片可提高栀子苷入脑量和入脑速度，其中以0.2 g/kg的冰片给药15min后，其BBB开放作用最明显。（2）基于微透析-UPLC-MS技术，对大鼠不同脑区的栀子苷入脑情况进行分析。我们首次发现冰片的BBB开放作用具有脑区特异性，其中以下丘脑和海马开放最明显，纹状体未见显著开放作用，而在皮层甚至表现出抑制BBB开放的趋势。（3）通过电镜检测发现0.2g/kg的冰片可引起海马区域内皮细胞和基膜直接的空隙增加，有利于BBB的开放。（4）小动物在体成像系统显示冰片可促进P-gp底物Rh123在海马和下丘脑的分布，提示冰片对该区域P-gp有抑制作用。（5）Western、RT-PCR和免疫组织荧光结果显示，冰片抑制海马和下丘脑区域的Mdr1a, Mdr1b and Mrp1三种蛋白的表达及其基因转录，但对Mrp4、Mrp5、Bcrp的表达却未见显著影响。而皮层和纹状体则对这6种蛋白均未见显著影响。（6）对冰片在以上四个脑区的分布进行研究，发现冰片在皮层的分布显著高于海马和下丘脑区域，而纹状体区域分布最少。结合上面的冰片不同剂量研究结果和微透析研究结果，提示冰片在脑区分布过多（如皮层）或过少（如纹状体）均不利于BBB的开放，而只有适当的脑内分布（如海马和下丘脑）才能真正开放BBB。（7）冰片还可增加抗抑郁药贯叶金丝桃的脑内分布。.本次研究的意义如下（1）对冰片的给药条件进行优化，在保证安全性的同时，确保其发挥最大效应，实验结果对临床组方用药具有重要指导意义。（2）基于微透析-UPLC-MS平台，建立了的一种灵敏、稳定、可靠的脑内药物实时监测方法。该平台对不同脑区脑内药动学分析提供一种新的策略。（3）通过脑内药动学和药效学研究技术的整合，发现了冰片自身的脑内分布与其BBB开放作用的非线性关系，进一步阐明了冰片“引药上行”作用特点及机制，指导临床用药。