胰高血糖素受体核酸适体的筛选、表征及其对葡萄糖稳态的影响

Elevated glucagon and its receptor over-activation increased gluconeogenesis of diabetes patients,involved in the pathogenesis and development of type 2 diabetes. Antagonizing glucagon receptor can improve insulin resistance and glucose homeostasis. Aptamers, specifically bind with small molecules, proteins , cells, etc.,have been increasingly used in basic biomedical research , disease diagnosis and drug development. We propose to select a set of aptamers specific for glucagon receptor (GCGR) by cell-SELEX method through over-expression the GCGR on cell surface.After characterization and functionalization,those aptamers then used to treat patients with diabetes through blocking GCGR.This project aim at obtain aptamers specific for GCGR by using HEK293 cells overexpressing hGCGR as positive cell lines for Cell-SELEX;Investigate the biological characteristic and functionization by different methods;Through animal experiments to verify aptamer’s binding ability and its effect on glucose homeostasis in obese C57BL/6 mice. This study will provide a theoretical basis and new molecular tools for drug development targeting the receptor.

胰高血糖素水平的升高及其受体的过度激活使糖尿病病人糖异生增加，参与T2DM的发生、发展。拮抗胰高血糖素受体能改善胰岛素素抵抗，改善血糖稳态。核酸适体通过形成特定的三维结构能与有机小分子、蛋白质、细胞等生物靶标高特异性结合，日益广泛应用于生物医学基础研究、疾病诊治和药物研发。我们提出通过在细胞系表面过表达胰高血糖素受体（GCGR）蛋白来进行Cell-SELEX筛选，以获得针对GCGR的特异性核酸适体，通过对该核酸适体进行表征及功能化，达到阻断GCGR来治疗糖尿病的目的。本项目以过表达hGCGR的HEK293细胞系为正细胞进行Cell-SELEX筛选，以期筛选出针对hGCGR 的特异性核酸适体；研究该核酸适体的生物学特性进行表征并修饰，通过动物体内实验来验证其结合性能并研究其对肥胖C57BL/6小鼠血糖稳态的影响。本研究将为针对该受体的药物开发及靶向载药提供理论基础及全新的分子工具。

1.项目的背景 .2型糖尿病（T2DM）以葡萄糖产生增多、胰岛素敏感组织对糖的利用减少以及胰岛细胞功能失调等多个代谢异常为特征。糖异生增加及糖原分解的抑制作用减弱是T2DM空腹血糖升高及糖耐量异常的主要原因。减少胰高血糖素水平和抑制GCGR活性有望减少葡萄糖生成过多，从而改善T2DM患者的血糖控制。核酸适配体是通过SELEX技术从人工合成的DNA／RNA文库中筛选得到的、能够高亲合性和高特异性地与有机小分子、蛋白质、细胞等生物靶标结合的单链寡核苷酸，本研究通过Cell-SELEX筛选 GCGR核酸适体并 在体研究其对血糖稳态的影响。 .2.研究内容 构建过表达hGCGR CHO细胞的细胞系并进行CELL-SELEX筛选，将筛选得到的核酸适体能过细胞实验对核酸适体进行表征并在体内研究该核酸适体对C57BL/6小鼠血糖相关参数的影响。 .3.重要结果 1）成功构建了真核表达载体 pcDNA3.1-GCGR，获得了在细 胞膜表面稳定表达 GCGR 的 CHO-K1 细胞系。 2）通过CELL-SELEX技术获得特异性结合CHO-GCGR细胞高亲和力的核酸适配体GR-3; Aptamer pull-down与 gcgr 干扰实验证实 GCGR 为核酸适配体 GR-3 的靶标蛋白; 3）PEG 修饰的核酸适配体GR-3可以降低T2DM小鼠空腹血糖，改善T2DM小鼠的葡萄糖耐量，降低小鼠胰岛素抵抗指数。 .4.关键数据 1）流式细胞术检测GR-3对CHO-GCGR细胞的平衡解离常数为52.68 ±5.06。 经PEG修饰的核酸适配体GR-3仍然可以与靶细胞较好的结合，而且稳定性明显提高。 2）HepG2 细胞在转染靶向 gcgr siRNA 后， GCGR 蛋白表达明显降低，流式细胞术检测发现转染 gcgr siRNA 的细胞不与 GR-3 结合; 3）DM小鼠模型腹腔注射GR-3以后，空腹血糖逐渐下降，干预第2周时，与模型对照组(vehicle)相比，GR-3组小鼠血糖显著下降(P<0.01);。. 5.科学意义 我们通过在细胞系表面过表达GCGR蛋白来进行Cell-SELEX筛选，获得了针对GCGR的特异性核酸适体GR-5， 为2型糖尿病的治疗提供全新的分子工具.